中药医院制剂活血益气方对裸鼠抑瘤作用及小鼠急性毒性的实验研究

陈 菲 冯英楠 庄 伟 张 鹏 林晓兰

(首都医科大学宣武医院药剂科，北京，100053)

中药医院制剂活血益气方对裸鼠抑瘤作用及小鼠急性毒性的实验研究

陈 菲 冯英楠 庄 伟 张 鹏 林晓兰

(首都医科大学宣武医院药剂科，北京，100053)

目的：测试首都医科大学宣武医院药剂科制剂活血益气方抗瘤丸的抑瘤作用及对小鼠的急性毒性。方法：将足够量的大鼠神经胶质瘤C6细胞注射至裸鼠右侧腋窝，建立裸鼠荷瘤模型，按瘤块体积随机分组，分别灌胃给予KLW的高、低剂量组，以替莫唑胺为阳性对照，以溶媒为阴性对照，期间测量裸鼠体重、瘤体积并观察给药前后动物症状；连续给药15 d后，处死全部小鼠，称量裸鼠瘤重量；剥离瘤块，采用Western Blot法检测肿瘤组织Bcl-2，Bax蛋白。选用ICR(Institute of Cancer Research，ICR)小鼠1 d内2次灌胃给药KLW，肉眼观察给药前、每次给药后连续4 h及14 d内小鼠的一般情况，中毒反应及死亡情况，结束观察后解剖，肉眼观察各组织脏器的变化。结果：裸鼠给药期间全部存活，体重正常增长，一般行为学观察未见明显异常。给药15 d后，KLW低、高剂量组，瘤体积、瘤重量较模型对照组显著减小；Bcl-2/Bax的比例较模型对照组显著增加。急性毒性试验中所有给药组小鼠在观察期内全部存活，一般行为学观察未见明显异常。供试品组2个性别的小鼠体重与阴性对照组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。剖检各组小鼠，肉眼观察各组织脏器未见病理改变。结论：KLW低、高剂量组对C6细胞移植瘤的生长具有明显的抑制作用，该作用与诱导胶质瘤细胞凋亡相关，与阴性对照组比较，差异有统计学意义(P>0.05)。KLW小鼠灌胃40 mL/kg BW，最大给药浓度(0.50 g/mL)，相当于临床人用剂量的107倍，未见明显毒性反应，使用安全性高。

抗瘤丸；神经胶质瘤；裸鼠；凋亡；小鼠；急性毒性

胶质瘤是中枢神经系统最常见的，恶性程度极高的一类肿瘤[1]。放、化疗不良反应严重，有一定的局限性，且疗效均不理想。中药治疗肿瘤具有一定的有效性，且安全性高，因此受到人们越来越多的重视[2]。医疗机构制剂活血益气方抗瘤丸(简称KLW)是针对神经胶质瘤的纯中药复方制剂。临床使用30余年，经验证明安全有效，价格低廉。然而作为医院制剂，缺乏系统的实验研究数据支持其抑瘤疗效及抑瘤机理，严重影响了该药的进一步开发与使用。故本文通过裸鼠抑瘤实验，研究KLW在裸鼠荷瘤模型中的抑瘤作用，以及与诱导胶质瘤细胞凋亡的关系，并通过小鼠急性毒性试验考察KLW的安全性，为KLW的进一步应用、研究、开发提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 ICR小鼠，雌雄各半，18～22 g；裸小鼠BALB/c，雄性，18～22 g(北京维通利华实验动物技术有限公司购买)。

1.1.2 药物 供试品医疗机构制剂活血益气方抗瘤丸，阳性药替莫唑胺胶囊(泰道)，简称TMZ(购于北京宣武医院)。

1.1.3 试剂与仪器 试剂：试剂胎牛血清(FBS)，DMEM培养基，胰蛋白酶，水合氯醛。仪器：CO2培养箱(NAPCO 6500型)，生物安全柜(CLASS TYPE B2型)，台式离心机(Eppendorf centrifuge 5430R)，电子数显卡尺(SF2000型)，倒置显微镜(Leica DM3000)，电子d平(PB602-N，TE2101-L)。

1.2 方法

1.2.1 分组与模型制备 按瘤块大小分组，使每组裸鼠的瘤块体积和体重平均值相似。制备模型：1)细胞培养：C6细胞培养在含10%胎牛血清(FBS)的DMEM培养基中，置37 ℃、5%CO2的培养箱中，常规培养。2)裸鼠荷瘤模型建立：将对数生长期的C6细胞悬液注射于裸鼠右侧腋下，5×106个细胞/只。小鼠急性毒性试验分组：将ICR小鼠按体重随机分组，每组雌雄各半。

1.2.2 给药方法 1)裸鼠抑瘤实验：分别灌胃给予不同浓度KLW：低剂量组0.85 g生药/kg，高剂量组3.4 g生药/kg，阳性对照组给予替莫唑胺43 mg/kg，模型对照组给予同体积溶媒(蒸馏水)。1次/d，连续给药15 d。2)小鼠急性毒性试验：分组后1 d内给药2次，给药间隔4 h。给药前禁食12～16 h，按分组时体重计算给药量，口服灌胃给药按40 mL/kg BW计算。实验组给予抗瘤丸最大给药浓度(0.50 g/mL)，阴性对照组灌胃给予等体积溶媒(蒸馏水)。

1.2.3 检测指标与方法 裸鼠抑瘤实验:1)肿瘤体积及瘤重：测量分别在给药第0、3、6、9、12、15 d测量裸鼠体重、肿瘤最大直径L(cm)和最小直径D(cm)，计算肿瘤体积V(cm3)的大小(肿瘤体积=1/2×L2×D)，观察裸鼠一般状态。并于给药15 d后处死，剥离瘤块称重。2)肿瘤组织Bcl-2，Bax蛋白Western Blot检测：每组随机取5个瘤块，剪碎组织，加入蛋白裂解液和PMSF，离心，所得上清液使用BCA法检测总蛋白浓度，调平。加入上样缓冲液，取等量蛋白上样，10%的电泳分离胶和5%的电泳浓缩胶中电泳。200 mA电流下转膜约2 h，0.1%脱脂奶粉-TBST封闭1 h，加Bcl-2或Bax一抗(1∶200稀释)，4 ℃过夜孵育后，漂洗6次，5 min/次，加入二抗(辣根酶标记山羊抗兔IgG，1∶5 000稀释)，室温孵育1 h后漂洗,在暗室用显色液显影，成像。3)一般状态观察：分别于给药前、每次给药后连续4 h、给药1次/d后连续观察14 d。观察给药当日对动物外观体征、行为活动、腺体分泌、呼吸、粪便及死亡等进行观察[3]。分别于给药当日给药前称体重，给药后第1、4、7、11、14 d称体重(以给药当d为D0d)。饲料加入量每次为150 g/笼，D0d首次给药后7～29 min内每笼加入约50 g饲料。分别于给药后第1、7、14 d收集饲料盒内的剩余饲料，用d平称重。

24 h摄食量=[(饲料给予量-饲料剩余量)/笼内动物体重的总和]×10 g

每日平均摄食量(g/10 gBW)=[(饲料给予量-饲料剩余量)/(d数×笼内动物体重的总和)]×10 g

4)剖检及观察：腹腔注射4%水合氯醛将小鼠麻醉，对动物进行外观检查，并对小鼠主要脏器，包括心、肝、脾、肺、肾、脑、胃、肠、气管、肾上腺、睾丸及附睾(雄性)、子宫及卵巢(雌性)、胸腺，进行剖检，肉眼观察有无明显的组织器官异常。对肉眼观察异常器官进行病理学检查。

表1 给药后各组裸鼠瘤体积

注：与模型组比较*P<0.05

2 结果

2.1 裸鼠抑瘤实验

2.1.1 行为学观察 裸鼠给药期间全部存活，一般状态未见明显异常，且组间比较，差异无统计学意义(P>0.05)。

2.1.2 瘤体积 给药15 d后，动物试验结果显示，KLW低、高剂量组，TMZ组能显著抑制C6细胞移植瘤的生长，与模型对照组比较具有统计学意义。见表1。

2.1.3 瘤体重量 给药15 d处死动物后，剥取各组动物瘤块称重进行比较，KLW-1低、高剂量组，阳性药对照组移植瘤的重量明显<模型对照组，差异具有显著性意义。见表2。

表2 给药15 d各组裸鼠瘤重量比较

注：与模型组比较*P<0.05

2.1.4 肿瘤组织Bcl-2，Bax蛋白 Western Blot检测结果显示，模型对照组能明显下调Bax的表达，KLW低、高剂量组和TMZ组，能明显上调Bax的表达，各组的Bcl-2都低表达，因此模型对照组Bcl-2/Bax的比例降低，各给药组Bcl-2/Bax的比例升高，各给药组都具有促进细胞的凋亡。见图1。

图1 C6裸鼠移植瘤中Bax，Bcl-2的表达

注：1.模型对照组；2.KLW低剂量组；3.KLW高剂量组；4.阳性对照组

2.2 小鼠急性毒性试验

2.2.1 小鼠一般状态 小鼠灌胃给药2次/d，在每次给药后4 h内，状态观察未见明显异常反应。给药后连续观察14 d，小鼠全部存活一般状态未见明显异常。KLW组与阴性对照组小鼠摄食量相近。见表3。

表3 抗瘤丸小鼠口服给药急性毒性试验摄食量结果统计表

图2 抗瘤丸对雄性小鼠体重的影响

图3 抗瘤丸对雌性小鼠体重的影响

2.2.2 体重测定 KLW组2个性别的小鼠在14 d观察期内体重均正常增长，与阴性对照组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。体重统计结果与体重增长见图2、3。

2.2.3 剖检结果 对阴性对照组和KLW组小鼠进行剖检，主要器官均未见异常。由于在剖检过程中，肉眼观察未见有病变的组织，器官，故未进行组织病理学检查。在本实验中，给予小鼠抗瘤丸0.50 g/mL，40 mL/kg BW时，相当于临床剂量的107倍，未见毒副反应。

3 讨论

胶质瘤是起源于脑部神经胶质细胞，临床常表现为头痛、恶心、呕吐、视力减退、复视、癫痫发作和精神症状等。本病属中医学“头痛”“真头痛”等疾病范畴。中医认为肿瘤的发生病理机制多由于人体正气不足,感受毒邪所致。胶质瘤毒邪内侵，痰瘀互阻证，日久化热，痰瘀热毒随风流注，善行数变，因此胶质瘤呈浸润性生长，手术难以切除干净，容易复发，因此药物治疗在抗胶质瘤中十分重要。

抗瘤丸清热解毒,活血化瘀,化痰散结，为治疗神经胶质瘤的中药复方制剂，国家“六五”重点科技攻关项目，获北京科技进步一等奖。北京军区总医院、天津医学院附属医院、北京大学第一附属医院等多中心临床试验结果显示，153例脑胶质瘤的平均有效率为64.7%[4]。回顾性研究表明，院内制剂KLW可以延长恶性神经胶质瘤的生存时间，具有肯定疗效[5]。然而，作为医院制剂缺乏有效性及安全性实验数据，限制其使用与发展。

恶性肿瘤细胞表现的增殖异常、凋亡抑制等特性在肿瘤的形成与转移中起着重要的作用。大量研究证明，KLW主要抗瘤成分包括三七、白花蛇舌草、半枝莲、白英、山楂、何首乌等抑瘤机理与诱导细胞凋亡相关[6-14]。前期裸鼠荷瘤预实验结果显示，KLW具有良好的抑瘤作用。经细胞学实验证明KLW的作用与抑制胶质瘤细胞C6、U87、U251的增殖作用有关[15-17]。

荷瘤裸鼠模型是经典模型，在肿瘤的前瞻性研究、抗癌药药理研究和抗癌药早期疗效评估中占据十分重要的地位。胶质瘤裸鼠异位移植模型水平的研究，比肿瘤细胞培养水平的研究，更能模拟人体内的肿瘤生长情况及药物吸收代谢情况，故在该模型中验证KLW的抑瘤效果能够很好的模拟临床治疗，结果可靠。研究结果显示，KLW高、低2个剂量组均能显著减小胶质瘤体积、降低瘤重量，与模型对照组比较具有统计学差异，证明KLW可在一定程度上抑制胶质瘤的生长，从而起到治疗作用。

正常情况下，细胞增殖与凋亡保持动态平衡，而恶性肿瘤细胞表现的增殖异常、凋亡抑制等特性在肿瘤的形成与转移中起着重要的作用。诱导肿瘤细胞凋亡是肿瘤抑制机理的重要方向[18]，在众多的凋亡调控基因中，Bcl-2蛋白家族备受关注，其中Bcl-2、Bax发挥重要作用，尤其是Bcl-2/Bax比率是启动细胞凋亡的“分子开关”[19]。研究结果显示，KLW能明显上调Bax的表达，导致Bcl-2/Bax的比例增加，促进细胞的凋亡。研究证明，KLW的抑瘤作用与促进胶质瘤凋亡相关。

本实验结果显示KLW具有一定的抑制胶质瘤作用，该作用与促进胶质瘤细胞凋亡相关。为进一步研究抗瘤丸作用机理指明方向。急性毒性试验结果显示KLW具有较高的安全性，小鼠在临床剂量107倍时未能检测到毒性。同时，与胶质瘤指南推荐药替莫唑胺比较，医疗机构制剂抗瘤丸作用较为缓慢，单日服药剂量较大，体现中药需较大剂量、长期服用，但安全性高的特点，为今后临床使用提供依据，为该药的进一步研发奠定基础。

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ExperimentalStudyonEffectsofHuoxueYiqiFangPreparedbyTCMHospitalinTumorInhibitedEffectsofNudeMiceandAcuteToxicityofMice

Chen Fei，Feng Yingnan，Zhuang Wei，Zhang Peng，Lin Xiaolan

(DepartmentofPharmacy，XuanwuHospitalofCapitalMedicalUniversity，Beijing100053，China)

Objective:To investigate the tumor inhibited effect and acute toxicity to mice by Huoxue Yiqi Fang Kangliu Wan (KLW) prepared by hospital.MethodsA plenty of glioma C6 cells were injected into right side of nude mice to establish nude mice model of bearing cancer.According to tumor volume，the nude mice were randomly divided into two groups，and separately to irrigate mice with high or low dose KLW.The temozolomide was as positive group and solvents (pure water) was as negative group.The weight and tumor volume of mice were investigated and symptoms were observed before and after medication.After continuous administration for 15 days，the mice were killed and tumors were weighted，and Western blot was used to detect Bcl-2，Bax.ICR mice were irrigated with KLW twice a day，then the general conditions，toxic reaction and death condition before administration and after administration 4 h and 14 days was reviewed with naked eyes.At last the mice were anatomized and organ changes of mice were observed.ResultsAll nude mice were alive in medication session with weight added，and there was no significant abnormality in general behavioral observation.After administration for 15 days，the tumor volume and weight were significantly declined in both high and low dose group.The scale model of Bcl-2/Bax of control group significantly grew.All administration group mice were alive and there was no significant abnormality in general behavioral observation in the period under observation.There was no significant difference between the two sexes of mice and the negative control group (P<0.05).Anatomical observation on each mice′s organ found no abnormality.ConclusionBoth high and low dose KLW have significant inhibiting effect on the growth of xenograft of C6 cells，and this effect was related to induced glioma apoptosis.It also has statistical significance compared with negative control group.KLW dose is 40 mL/kg BW and maximum dose is 0.50 g/mL，which are 107 times of human clinical dose.There is no significant toxicity effect，so it is safe.

Kangliu Wan; Glioma; Nude Mouse; Apoptosis; Mouse; Acute Toxicity

北京市科委十病十药研发专项(Z20141100002214016)；首都中医药研究专项(17Z13)

陈菲(1984.11—)，女，硕士，主管药师，研究方向：中药学中药新药研发方向，E-mail：chenfeijill@163.com

林晓兰(1963.08—)，女，学士，主任药师，行政副主任，研究方向：中药学中药制剂研发与医院药学管理方向，E-mail：xllin83@163.com

R285.5

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2017.10.037

(2016-06-13收稿 责任编辑：张文婷)