透明质酸、TGF-β1对下颌骨髁突软骨增殖分化的影响

蔺栋鹏 吕瑾茹 赵天一 王永功 彭利伟 马秦

透明质酸、TGF-β1对下颌骨髁突软骨增殖分化的影响

蔺栋鹏 吕瑾茹 赵天一 王永功 彭利伟 马秦

目的研究透明质酸(HA)、TGF-β1因子对下颌骨髁突软骨增殖分化的影响。方法取新生小鼠的下颌骨髁突软骨体外进行组织培养，按培养液内添加因子不同分为对照组、HA(0.5 mg/ml)、TGF-β1(5 ng/ml)组，于培养1、2、4、6、8 周后进行形态学观察、软骨面积测量、茜素红染色以及碱性磷酸酶染色研究。结果对照组中髁突软骨在培养4 周后软骨内开始出现高密度光阻射区，茜素红染色、碱性磷酸酶染色提示软骨基质出现了钙化、软骨内成骨的过程；HA组中髁突软骨内未出现高密度光阻射区，而髁突软骨面积却显著增大(P<0.05)；TGF-β1组中髁突软骨在培养2 周后提前出现了高密度光阻射区，然软骨面积无显著改变(P>0.05)。结论在体外培养下，HA可以促进髁突软骨的增殖，对软骨细胞的肥大分化有一定的抑制作用，TGF- β1 在早期可显著促进髁突软骨细胞的肥大分化。

下颌骨髁突软骨； 组织培养； 体外； 透明质酸； TGF- β1； 增殖分化

颞下颌关节骨关节炎(TMJ OA)是发生于成人颞颌关节区的骨关节炎，其显著特征是髁突软骨基质进行性降解，并引起一系列临床症状，给患者的生活质量造成很大的影响。研究显示[1]，OA的病理改变类似于软骨内成骨过程中软骨细胞的肥大分化过程。透明质酸(HA)是一种高分子量的粘多糖，构成了关节软骨与滑液的主要成分，关节腔内注射HA不仅被广泛应用于治疗OA引起的疼痛[2]，而且还能够延缓OA的进程[3]。转化生长因子(TGF-β)在软骨细胞的增殖分化中起重要作用，TGF-β1属于TGF-β超家族中的一个亚型，实验证明TGF-β1不仅可以抑制软骨细胞的肥大分化，而且能维持未分化的软骨细胞表型[4]。本人在前期实验已成功建立了髁突软骨在体外培养下软骨细胞发生肥大分化，自发基质钙化的模型。本次研究使用前期的实验模型，探讨HA、TGF-β1对髁突软骨细胞增殖分化的影响，为临床上研究髁突软骨细胞增殖分化异常导致的疾病提供一定的依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 选用新生3 d的昆明小鼠子鼠，平均体重为2.1 g，由第四军医大学动物实验中心提供，实验由大学伦理委员会批准实施。

1.1.2 主要试剂 IMDM培养液(Hyclone,美国)，100 μg/ml青链霉素(Solarbio,北京), β-甘油磷酸盐、苏木精伊红染液、0.05%茜素红染色液、0.01% light green solution(Sigma,美国)，4%多聚甲醛固定液、碱性磷酸酶染色液试剂盒(Leagene，北京)，PBS(实验室提供)，梯度酒精等。

1.1.3 主要设备 超净工作台、生物组织包埋机、展烤片机(爱华，天津)，石蜡切片机(Leica,德国)，电热恒温干燥箱(东星，上海)，培养箱，体视显微镜、倒置显微镜 (Olypus,日本)，12孔板，显微外科手术器械等。

1.2 方法

1.2.1 分组取材 采用新生3 d的昆明小鼠子鼠30 只，在超净工作台内，断颈处死后得到60 支髁突组织，按培养液内添加因子不同分为3 组(对照组、TGF-β1组，HA组)，每个实验组按照不同时间点(1、2、4、6、8 周)进行实验研究。其中，髁突组织被切长度约2 mm，要求包含全部髁突软骨和部分骨组织。

1.2.2 体外组织培养 将取好的软骨组织先用无菌PBS液冲洗10 min后，再用配置好的IMDM培养液(含100 μg/ml青链霉素，β-甘油磷酸盐5 mmol/L)冲洗2 次，每次5 min。随后将髁突软骨组织放入12 孔板内，每孔含IMDM培养液1 ml。最后将培养板放入37 ℃，含CO2浓度为5%的恒温箱内，培养液每周更换3 次。其中HA组中培养液采用的浓度是0.5 mg/ml[5]，TGF-β1组中培养液采用的浓度是5 ng/ml[6]。

1.2.3 形态学观察与软骨面积测量 分别于5 个时间点(1、2、4、6、8 周)对软骨组织进行形态学观察与软骨面积测量，具体方法：采用倒置显微镜观察，每次使用相同的倍数(×40)、标尺及其它光学参数，保持软骨组织在同一水平面，拍摄照片后将其导入Cellsens 1.7显微图像软件，在软件中利用多边形测量工具测量软骨的面积 (S,μm2)，每个时间点测量6 张图片，每张图片测量5 次，并记录数值。软骨面积具体测量见图 1。

图 1 髁突软骨面积测量

1.2.4 茜素红染色 石蜡切片常规脱蜡、水化、漂洗后，切片入0.05%茜素红染液30 min，漂洗2 min后，再入0.01%Light green solution 5 min，最后脱水、二甲苯透明、中性树胶封片、干燥。

1.2.5 碱性磷酸酶染色 石蜡切片常规脱蜡、水化、漂洗后，切片入ALP孵育液，37 ℃孵育2～12 h。蒸馏水漂洗5 min后，切片入硝酸钴溶液，37 ℃孵育5 min。蒸馏水漂洗5 min后，切片入ALP硫化工作液，37 ℃孵育2 min。最后蒸馏水漂洗，苏木精复染细胞核1 min,二甲苯脱水，透明，中性树胶封片、干燥。

1.3 统计学分析

本实验软骨面积测量数据比较采用单因素方差分析。统计学显著差异为P<0.05。

2 结 果

2.1 形态学观察与软骨面积测量

通过倒置显微镜观察，可以看到各培养组在体外培养下，软骨组织没有发生崩解坏死现象。空白培养组中髁突软骨在培养4 周后，髁突软骨后缘与骨交界处出现了高密度光阻射区，培养6 周结束，高密度光阻射区延伸至对侧软骨，培养8 周后高密度光阻射区几乎占据整个软骨区域(图 2)。TGF-β1 组在培养2 周后，高密度光阻射区提前发生，培养4 周后，软骨内高密度光阻射区延伸至对侧软骨，培养6 周、8 周结束，高密度光阻射区同样几乎占据整个软骨区。HA组髁突软骨自培养初至培养8 周结束，软骨内均未观察到高密度光阻射区。随着培养时间推进，HA组中髁突软骨面积呈上升趋势；而对照组与TGF-β1组，髁突软骨面积无明显变化。HA对髁突软骨的增殖具有显著促进作用(P<0.05)，而 TGF-β1对于髁突软骨的增殖无显著作用(P>0.05)(图 3)。

图 2 形态学观察结果(×40)

Fig 2 Morphological observation(×40)

图 3 髁突软骨面积直方图

2.2 茜素红染色

对照组中髁突软骨在培养4周后胞外基质(ECM)发生了钙化，而TGF-β1组中髁突软骨培养2 周后，ECM钙化提前发生，培养4 周后，ECM钙化几乎占据了大部分软骨层。而HA组中髁突软骨内尚未发现ECM钙化(图 4)。

2.3 碱性磷酸酶染色

对照组与TGF-β1组中髁突软骨培养4周后，碱性磷酸酶活性不仅表达于钙化软骨层及骨组织，而且表达于发生肥大分化的软骨细胞及胞外基质。培养8 周结束，碱性磷酸酶表达更为明显。碱性磷酸酶活性的增强提示软骨细胞发生的肥大分化，其实质是正在经历软骨内成骨的一个过程。而HA组中髁突软骨除肥大层及骨组织表达阳性外，其余软骨层未见明显表达(图 5)。

3 讨 论

3.1 骨关节炎与软骨细胞肥大分化

髁突软骨属于继发性软骨，其生长特性与长骨生长板软骨不同，主要由纤维软骨构成，易受到局部因素的影响[7]。本实验中髁突软骨在体外培养条件下，发生的软骨细胞肥大分化，自发基质钙化的现象，主要由髁突软骨的生长特性决定的。髁突软骨细胞的肥大分化过程主要存在于软骨内成骨(EO)的过程中，髁突软骨增殖层中含有未分化的间充质细胞，该细胞具有多向分化的潜能，在基因的调控下细胞开始聚集增殖分化为软骨细胞，随后软骨细胞停止增殖发生肥大化[8]，最终肥大分化的细胞被成骨细胞所代替，并表达自身特有的标记物ALP、X型胶原。骨关节炎是一种以ECM降解为特征的退行性疾病，正常的关节软骨细胞在生理环境下，通过适度的代谢活性，以维持ECM的组成。而在病理环境下，一些关节软骨细胞失去了分化表型，软骨细胞进入了一个类似于EO的增殖过程和肥大分化过程[9]，并伴随着肥大分化阶段显著的标记物表达，如ALP[10]，X型胶原等。因此本实验在体外培养下髁突软骨细胞发生肥大分化，基质钙化的模型可以作为体外骨关节炎模型来研究。

图 4 茜素红染色(×40)

Fig 4 Alizarin red staining(×40)

图 5 碱性磷酸酶染色(×100)

Fig 5 Alkaline phosphatase staining(×100)

3.2 TGF-β1早期促进髁突软骨细胞肥大分化

本实验添加TGF-β1的培养组中，早期培养2 周后髁突软骨细胞开始发生肥大分化，形态学观察看到了明显的高密度光阻射区，茜素红染色证实ECM发生了钙化，碱性磷酸酶染色表明软骨细胞正经历着软骨内成骨的过程，然而软骨面积与对照组相比无明显差异。这表明TGF-β1早期促进了髁突软骨细胞的肥大分化，但对软骨细胞的增殖并无显著影响。Delatte[11]在体外培养髁突软骨发现，培养液内添加TGF-β1可以显著增加髁突软骨中GAG、胶原的含量，但TGF-β1对髁突软骨细胞的增殖并无明显影响。这与本实验结论有相似之处。Livne[12]在体外组织培养中研究发现TGF-β1能够明显促进TMJ OA鼠的下颌骨髁突软骨细胞的基质合成，还可诱导增强碱性磷酸酶的代谢活性。本实验中TGF-β1组髁突软骨培养2 周后，ALP的活性增强与其结论一致。另外，TGF-β1对于髁突软骨细胞增殖分化的影响，除受自身生物学特性影响外，还可能与TGF-β1的浓度、培养时间、培养环境等因素有关。

3.3 HA抑制髁突软骨细胞肥大分化，促进软骨增殖

HA由B型滑膜细胞分泌，具有润滑、营养和保护关节软骨结构的功能。本实验添加HA的培养组中，形态学观察髁突软骨内始终未出现高密度光阻射区，茜素红染色也未发现ECM钙化现象，碱性磷酸酶染色表达阴性证实了髁突软骨细胞并未发生肥大分化。而髁突软骨面积直方图明显看到HA对髁突软骨的增殖作用显著。因此可以认为，在体外环境下，HA 对于髁突软骨细胞的肥大分化存在一定的抑制作用，但能显著地促进了软骨的增殖。HA目前被越来越多运用于临床治疗OA引起的关节疼痛，实验研究表明HA能够延缓OA的进程。赵天一[13]利用本实验的研究模型证实了HA可以抑制下颌骨髁突软骨钙化，并对其发生的可能机制进行了阐述；这与本实验研究发现一致。Christopher[14]在研究关节软骨细胞的特性实验中发现，培养系统中加入HA后，对于软骨细胞基质的产生和软骨细胞的增殖活性有明显的促进作用。而外源性的HA治疗OA的生理效应很大程度还取决于HA的分子质量，高分子质量的HA 关节腔内注射较低分子质量HA对于OA引起的疼痛更为有效[15]。本实验中HA抑制了软骨细胞的肥大分化，从临床角度看在一定程度上缓解了OA的病理过程，但对其确切的机制还需进一步研究。

综上所述，本实验在前期实验的基础上，进一步探讨了TGF-β1、HA对于髁突软骨增殖分化的影响。TGF-β1早期对软骨细胞肥大分化的促进作用，HA促进髁突软骨增殖，抑制软骨细胞肥大分化的结果将对后期更深入的研究与其相关的临床疾病提供了可靠的依据。

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TheeffectsofhyaluronicacidandTGF-β1onthegrowthofmandibularcondylarcartilageandthehyperthophicdifferentiationofthecondylarchondrocyts

LINDongpeng1,LVJinru2,ZHAOTianyi3,WANGYonggong1,PENGLiwei1,MAQin4.

1. 450000Zhengzhou,DepartmentofStomatology,HenanProcincialPeople'sHospital,China; 2.DepartmentofStomatology,ZhengzhouPeople'sHospital; 3.DepartmentofStomatology,SuzhouDentalHospital,China; 4.StateKeyLaboratoryofMilitaryStomatology&NationalClinicalResearchCenterforOralDiseases&ShaanxiClinicalResearchCenterforOralDiseases,DepartmentofOralandMaxillofacialSurgery，SchoolofStomatology,TheFourthMilitaryMedicalUniversity,Xi'an

Objective: To study the effects of hyaluronic acid(HA) and TGF-β1 on the growth of mandibular condylar cartilage and the hyperthophic differentiation of the condylar chondrocyts.Methods60 condyle samples from newborn mice wereinvitrocultured and treated with HA(0.5 mg/ml), TGF- beta 1(5 ng/ml) and without additional agent(the control) respectively. The Morphological observation,Alizarin Red Staining, Alkaline phosphatase staining and condylar cartilage surface area measurement were conducted after 1, 2, 4, 6 and 8 weeks of culture respectively.ResultsHigh-density photoresist area was observed in the condylar cartilage of the control group after 4 weeks of culture. Alizarin Red Staining and Alkaline phosphatase staining showed condylar cartilage matrix production and calcification.The HA group showed no high-density photoresist area at all time points, however, the cartilage area was significantly increased(P<0.05); the TGF-beta 1 group showed high-density photoresist area after 2 weeks of culture. but the cartilage area were not significantly changed(P>0.05).ConclusionHA can promote the growth of condylar cartilageinvitro, but have an inhibitory effect on chondrocyte differentiation. TGF-β1 plays a role in mandibular condylar chondrocyte hypertrophic differentiation in the early days ofinvitroculture.

Mandibularcondylarcartilage;Tissueculture;Invitro;Hyaluronicacid(HA);TGF-β1;Hyperplasia

十二五军队重点课题(编号： BWS11J046)

450000 郑州， 河南省人民医院口腔颌面外科(蔺栋鹏 彭利伟 王永功)； 郑州人民医院口腔科(吕瑾茹)； 苏州口腔医院(赵天一)； 军事口腔医学国家重点实验室， 口腔疾病国家临床医学研究中心, 陕西省口腔疾病临床医学研究中心, 第四军医大学口腔医院颌面外科(马秦)

马秦 E-mail： qinma@fmmu.edu.cn

R782.6

A

10.3969/j.issn.1001-3733.2017.05.003

(收稿： 2017-03-28 修回： 2017-03-30)