应用响应面法优化红树莓组培苗增殖培养条件

郭芳+刘海鹏+李保国+张雪梅+齐国辉+李迎超+张玲+许洋

摘要：在单因素试验基础上，根据Box-Behnken中心组合（BBD）试验原理，选取6-BA浓度、光照度、增殖周期为试验因素，以增殖系数为响应值，采取3因素3水平响应面法进行回归模型分析，以优化红树莓组培苗增殖的培养条件。结果表明，以无透气孔的塑料盖为封口材料，红树莓组培苗增殖的最佳培养条件为6-BA 1.59 mg/L、光照度 1 391 lx、增殖周期42 d，在此条件下红树莓组培苗的增殖系数预测值为10.950，验证得到的实际值为11.019。

关键词：响应面法；培养条件；红树莓；增殖系数；光照度；增殖周期

中图分类号： S663.204+.3 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2017）18-0056-04

收稿日期：2016-04-17

基金项目：河北省科技支撑计划（编号：16226806D）；国家现代农业科技成果惠民示范工程 （编号：Z141100002314009）。

作者简介：郭 芳（1990—），女，河北卢龙人，硕士研究生，从事经济林栽培生理研究。E-mail：guofang901003@163.com。

通信作者：李保国，博士，教授，博士生导师，主要从事经济林栽培生理和山区开发技术研究及经济林栽培教学工作。E-mail：13582620586@163.com。 红树莓（Rubus idaeus L.）为蔷薇科悬钩子属多年生落叶灌木，别称覆盆子、马林、托盘等，果实为聚合果，富含果糖、维生素、氨基酸等，风味香醇，酸甜可口，在世界上被誉为“黄金水果”，具有防癌、抗氧化、解热镇痛、抗血凝等保健药用功能，现广泛应用于化妆、医药、食品、保健等领域，成为最具潜力的第3代新兴保健水果[1-2]。发展红树莓，大量的优质苗木是关键。目前，红树莓苗木生产主要依靠根蘖繁殖，不仅繁殖系数低、速度慢，而且连续根孽繁殖会造成品种退化，易通过苗木传播土壤病虫害。利用组织培养技术进行红树莓脱毒快繁是快速繁育优良苗木的最佳途径，我国已在猕猴桃、枣树、草莓等树种上建立了相关的繁育体系[3-5]。对于红树莓，前人的研究大多集中在最佳培养基筛选[6-10]，而对其培养条件的优化研究尚无报道。

6-BA为人工合成的细胞分裂素类化合物，能够显著促进细胞分裂、调控营养物质运输、促进植物新陈代谢等[11]。光强直接影响植物的生长发育和结构特征，而封口材料则会影响培养瓶内的通气性，进而影响容器内湿度及气体与外界的交换。响应面分析法作为一种优化工艺条件的有效方法，可以精确表述因素和响应值之间的关系，现已被广泛用于多因素影响的试验优化上。本研究在6-BA、光照度、封口方式及增殖周期等单因素对红树莓组培苗增殖影响试验的基础上，将响应面法应用于红树莓组培苗增殖培养条件的优化，以确立红树莓组织培养育苗技术体系，为红树莓组织培养工厂化育苗提供理论支撑。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料为“海尔特兹”红树莓继代组培苗1 cm左右的带芽茎段。MS基本培养基，其蔗糖含量为30 g/L，琼脂为 5 g/L，高压灭菌前pH 值为5.8。

1.2 试验设计

1.2.1 单因素试验

1.2.1.1 6-BA浓度对红树莓组培苗增殖的影响 光照度2 000 lx、增殖周期30 d、封口方式选择无透气孔的塑料盖，设定6-BA处理浓度分别为0、0.5、1.0、1.5、2.0 mg/L。

1.2.1.2 光照度对红树莓组培苗增殖的影响 6-BA 1.0 mg/L、增殖周期30 d、封口方式选择无透气孔的塑料盖，设定光照处理强度分别为500、1 000、1 500、2 000、2 500 lx。

1.2.1.3 增殖周期对红树莓组培苗增殖的影响 6-BA 1.0 mg/L、光照度2 000 lx、封口方式选择无透气孔的塑料盖，设定增殖处理周期分别为30、40、50、60 d。

1.2.1.4 封口方式对红树莓组培苗增殖的影响 6-BA 1.0 mg/L、光照度2 000 lx、增殖周期30 d，设定封口处理方式分别为无透气孔的塑料盖、普通封口膜。

1.2.2 红树莓组培苗增殖培养条件的优化 采用响应面分析法，根据中心组合试验（BBD）设计原理，确定6-BA、光照度、增殖周期3个因素作为中心组合试验因子（表1），增殖系数为响应值，进行响应面试验设计（表2）。

1.3 试验方法

试验于2015年8—10月在河北省南和县河北至高点农业科技有限公司组培中心进行，选用容积为240 mL的培养瓶，每瓶接入7個红树莓茎段，均匀分布；各试验随机区组设计，每处理20瓶，重复5次；培养室内培养30 d，调查其增殖系数，培养条件为温度（25±2） ℃，湿度（50±5）%，光周期14 h/d。

1.4 数据处理

采用LSD法及Design-Expert 8.0.5软件对试验数据进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 6-BA浓度对红树莓组培苗增殖的影响 由表3可知，随培养基中6-BA浓度的升高，红树莓组培苗的增殖系数逐渐增加，6-BA浓度达到1.5 mg/L时增殖系数达到最大，为5.267；当6-BA浓度增加到2.0 mg/L时，红树莓组培苗的增殖系数反而减小，说明6-BA浓度为2.0 mg/L时红树莓组培苗的增殖生长受到抑制。因此，红树莓组培苗增殖的最适6-BA浓度为1.5 mg/L。

2.1.2 光照度对红树莓组培苗增殖的影响 由表3可知，随光照度的增加，红树莓组培苗的增殖系数逐渐增加，光照度达到1 500 lx时，增殖系数达到最大，为6.419；当光照度增加到2 000 lx时，红树莓组培苗的增殖系数反而减小，说明当光照度超过2 000 lx 时，红树莓组培苗的增殖生长受到抑制。因此，红树莓组培苗增殖的最适光照度为 1 500 lx。endprint

2.1.3 增殖周期对红树莓组培苗增殖的影响 由表3可知，随增殖周期由30 d延长到40 d，红树莓组培苗的增殖系数逐渐增加，增殖系数达到6.962，

2.1.4 封口方式对红树莓组培苗增殖的影响 由表3可知，以无透气孔塑料盖为封口材料的红树莓组培苗，其增殖系数显著优于普通封口膜（P<0.05），且以普通封口膜为封口材料的红树莓组培苗明显发黄，甚至发生死亡，这一方面可能是由于普通封口膜完全将培养瓶密封，而塑料盖与培养瓶之间为螺旋状连接，增加了容器的透气性，培养过程中CO2得到补充，从而提高了组培苗的光合自养能力，进而影响其增殖，另一方面可能是光透过普通封口膜后被吸收或反射了利于红树莓组培苗进行光合作用的光谱，使其净光合速率降低。因此，增殖的最适封口方式为无透气孔的塑料盖。

2.2 红树莓组培苗增殖培养条件的优化

2.2.1 试验结果回归分析 根据表2试验结果，以6-BA（X1）、光照度（X2）、增殖周期（X3）为自因素，以增殖系数（Y）为响应值，得回归方程模型为Y=-42.607 86+9.666 19X1+0.015 516X2+1.671 83X3+0.000 9X1X2+0.022 857X1X3+0000 06X2X3-3.746 67X12-0.000 007X22-0021 367X32（R2=0.994 0），该回归拟合模型经方差检验达到极显著水平（表4），响应值的变化有99.40%来源于所选自变量；该模型决定系数R2=0.994 0与决定系数R2Adj=0986 3相近，表明该方程与数据拟合度良好，试验误差小，可用于对红树莓组培苗增殖情况的分析预测。由表4可见，6-BA浓度、光照度、增殖周期的一次项、二次项变化对红树莓组培苗的增殖有极显著影响，光照度和增殖周期交互项对红树莓组培苗增殖有显著影响，而6-BA和光照度、6-BA和增殖周期交互项对红树莓组培苗增殖的影响不显著，各试验因素对响应值的影响不是简单的线性关系；失拟项检验P=0.109 3>0.05，说明试验无其他显著因素的影响，可信度比较高[12]。

2.2.2 响应面分析 通过多元回归方程所作响应面曲线图及等高线图可以直观地反映6-BA浓度、光照度和增殖周期对红树莓组培苗增殖的影响。由图1、图2、图3可见，增殖周期对红树莓组培苗增殖的影响最为明显，曲线面最陡；其次是光照度，曲线面较陡；影响作用最小的是6-BA浓度，曲线面趋于平缓；各因素所选范围内均存在极值点；光照度和增殖周期的交互作用显著，6-BA和光照度、6-BA和增殖周期的交互作用不显著。

2.2.3 模型方程的验证 通过Design-Expert 8.0.5软件求出回归模型的极值点，得到以无透气孔塑料盖为封口材料时红树莓组培苗增殖培养的最优条件为6-BA 1.59 mg/L、光照度1 390.81 lx、增殖周期41.97 d，此条件下增殖系数理论值为10.950。验证试验培养条件调整为6-BA 1.59 mg/L、光照度1 391 lx、增殖周期42 d，重复3次，得到增殖系数真实平均值为11.019，与理论预测值非常相近，这说明该模型可信，响应面法可用于红树莓组培苗增殖培养条件的优化。

3 结论与讨论

单因素试验结果表明，红树莓组培苗增殖培养的最适 6-BA浓度为1.5 mg/L、光照度为1 500 lx、增殖周期为 40 d，以无透气孔塑料盖对容器进行封口。在此基础上，设计BBD中心组合试验进行响应面分析，得到红树莓组培苗增殖的最佳综合培养条件为6-BA 1.59 mg/L、光照度 1 391 lx、增殖周期42 d，此时紅树莓组培苗的增殖系数理论值为10950，实际验证增殖系数为11.019，两者高度接近，说明响应面法用于红树莓组培苗增殖培养条件的优化是可靠的。

6-BA是一种细胞分裂素，其主要作用是促进细胞分裂，但浓度过高则会抑制芽的发生。本研究中，当6-BA浓度大于1.5 mg/L时，红树莓组培苗的增殖开始受到抑制，而其影响红树莓生长的机理有待进一步研究。封口方式对组培苗的增殖会产生影响，封口方式不同使容器内外的气体交换产生差异，从而对培养容器中气体组成[13]、芽伸长、温度、湿度及增殖等产生影响[14-15]。Tsuro等试验表明，透气状况的改善可提高增殖培养的效率[16-17]。本试验中选择无透气孔的塑料盖进行封口，对红树莓组培苗的增殖效果要显著好于普通封口膜，除由于透气不同外，也可能是光透过普通封口膜后，被吸收或反射了有利于红树莓组培苗进行光合作用的光谱，使其净光合速率降低，从而导致增殖率降低，具体原因也有待进一步研究。

对于培养条件的优化，主要方法有单因素试验、正交试验法、响应面法等。单因素试验常用于确定某一因素的使用范围，方法简单、容易，结果明了，但忽略组分间的交互作用，可能会完全丢失最适宜的条件；正交试验法虽研究多因素、多水平的组合，但只能对一个个孤立的试验点进行分析，并不能在给出的整个区域上找到因素和响应值之间一个明确的函数表达式；响应面法采用多元二次回归模型拟合各因素与响应值之间的关系，试验数少、周期短、回归方程精度高，并能克服正交试验只能处理离散水平值，而无法找出最佳组合和响应值的缺陷[18]。近几年，响应面法在食品学、生态学等领域得到广泛应用[19-22]。本试验选取6-BA浓度、光照度、增殖周期3个因素，利用响应面分析法优化红树莓组培苗的增殖培养条件并获得成功，为红树莓组织培养的工厂化育苗提供了一定的理论支撑。

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