雌黄连木遗传多样性

管菊+李琬婷+黄晓霞+程小毛

摘要：利用10对扩增片段长度多态性（AFLP）引物对来自河南长葛、安阳2个地区5个不同种群的139份雌黄连木样品进行遗传多样性研究。结果显示，在种水平上，香农（Shannon）信息指数（Ⅰ）为0.492 7，Neis基因多样性指数（He）为0.335 3，表明雌黄连木种群的遗传多样性处于中等水平。在研究中雌黄连木的遗传分化系数Gst为0.150 8，由分子变异方差分析（AMOVA）显示，85.25%的变异存在于种群内，以上2个结果都表明：雌黄连木种群间存在较低的遗传分化，且遗传变异主要来源为种群内。基因流Nm为2.814 9，表明较高的基因流可能是导致雌黄连木具有中等遗传多样性的主要原因之一。

关键词：黄连木；遗传多样性；遗传分化；AFLP

中图分类号： S567.1+90.1 文獻标志码： A 文章编号：1002-1302（2017）18-0116-03

收稿日期：2017-03-17

基金项目：国家自然科学基金（编号：31560217）；国家林业局西南风景园林工程技术研究中心建设项目；云南省高校重点建设学科（风景园林学）建设项目。

作者简介：管 菊（1991—），女，云南宣威人，硕士研究生，主要从事园林植物研究。E-mail：630958865@qq.com。

通信作者：程小毛，博士，副教授，主要从事林木遗传育种研究。E-mail：30375713@qq.com。 黄连木（Pistacia chinensis）是一种高效多油的落叶植物，富含不干性油[1]，是我国解决能源危机的重要能源树种。黄连木抗性及适应性强，分布广泛，是重要的山地造林树种之一。我国部分区域有不少荒山贫瘠地，不宜耕作生产，而作为重要生物质能源的黄连木具有广阔的种植空间[2]。同时，黄连木富含黄酮类、单宁、萜类及不饱和脂肪酸等生物活性成分，不仅可供食用，且是重要的药用和材用树种[3]。目前，黄连木的繁殖一般只能依靠种播，作为雌雄异株、以种子为重要利用部分的能源植物，黄连木雌株也就具有最直接的经济价值[4]，因此，研究雌黄连木遗传多样性显得尤为重要。

在众多的分子遗传标记中，扩增片段长度多态性（AFLP）指纹标记技术具有稳定高效、方便可靠、无需预先知道基因信息等特点，在物种资源管理和种群遗传多样性以及其他研究领域占有非常重要的地位[5-6]。本研究以河南省安阳市、长葛市2个地区共5个地点所采集的雌黄连木为试验材料，首次采用AFLP标记技术，对其种群的遗传关系进行研究，从而明确不同区域雌黄连木资源的遗传多样性水平和种群结构，以研究其变化规律，为将来雌黄连木种质鉴定、分类地位的确立提供科学依据，同时也为黄连木良种选育及广泛推广种植奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本试验所采用的材料为2015年3月中旬在河南省安阳市、长葛市2个地区共5个地点采集的雌黄连木嫩叶，将不同地点的试验材料作为1个种群处理，取样地点分别在长葛市和安阳市的南沟村（西沟北坡）、南沟（东后凹）、南沟（西后凹）、安阳监狱，各个种群分别采样59、16、14、20、30株，共139株个体，每株个体随机采其嫩梢，单株取样个体间间距保证在30 m以上，取样后存入有硅胶干燥剂的自封袋中干燥保存。

1.2 试验方法

1.2.1 DNA提取 提取雌黄连木基因组DNA的方法为十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）改良法[7]，并适当修改。取雌黄连木干燥嫩叶6 g，用液氮迅速研磨成粉，加入600 μL CTAB提取液以及少量聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、15 μL β-巯基乙醇。摇匀后，迅速放入65 ℃水浴锅中水浴45 min。后加入等体积三氯甲烷+异戊醇（体积比24 ∶ 1），上下颠倒混匀，离心16 min，取上清液，再加入等体积三氯甲烷+异戊醇（体积比24 ∶ 1），摇匀离心16 min。取上清液，加入10 μL RNase A酶。检测DNA质量用1%琼脂糖凝胶，检测后将剩余DNA稀释为50 ng/μL，放入-20 ℃冰箱保存待用。

1.2.2 雌黄连木AFLP反应体系 AFLP反应体系参考程小毛等的方法[8]，于Gene Amp PCR system 9700（Applied 73 Biosystems）上进行。

1.2.2.1 酶切 每个反应总体积为25 μL，其中包括150 ng DNA，2.5 U Eco R Ⅰ，1.5 U MseⅠ，2.5 μL 10× Tango buffer，加ddH2O至12.5 μL。反应程序：37 ℃ 5 h，65 ℃ 2 h，85 ℃ 20 min。

1.2.2.2 连接 酶切后，每个DNA样品中加入12.5 μL连接混合液（各5 μL Eco R Ⅰ、MseⅠ接头，0.75 U T4 DNA连接酶，2.5 μL 10×T4 Buffer，加ddH2O至12.5 μL）。反应程序：22 ℃ 3 h，65 ℃ 10 min，反应结束后将产物稀释5倍待用。

1.2.2.3 预扩增 取5 μL连接稀释后的DNA样品，各加入20 μL预扩增混合液，含2.5 μL 10×PCR Buffer（Mg2+），2 μL 2.5 μmol/L dNTP，1 μL 10 μmol/L primer，0.2 μL Taq DNA聚合酶，14.3 μL ddH2O。混匀后，按以下程序进行反应：95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，25个循环；72 ℃ 5 min。将预扩增产物稀释20倍备用。

1.2.2.4 选择性扩增 取2 μL预扩增稀释混合液，各加入8 μL选择性扩增混合液[1.0 μL 10× PCR Buffer（Mg2+），0.8 μL 2.5 mmol/L dNTPs，0.8 μL 10 μmmol/L primer，0.1 μL 5 U/μL Taq DNA 聚合酶，加ddH2O至8 μL]。混匀后，按以下程序反应：95 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，65 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，13个循环；95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，23个循环； 72 ℃ 5 min；95 ℃ 5 min，结束后立刻用冰浴冷却待用。AFLP引物与接头序列见表1。endprint

1.2.3 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）检测 PCR产物经6%聚丙烯酰氨凝胶电泳后，参照程小毛等的方法[9]进行银染显色，流水冲洗干净，置于室内自然干燥后，在灯箱上拍照记录并分析相关数据。

1.3 带型统计与数据分析

使用人工读带的方法，将基因型转化成数字矩阵，在同一水平线上，把电泳图上较清晰的条带记为“1”，同一位置不存在条带或有不易分辨的弱带记为“0”。采用POPEGENE version1.31进行分析和计算雌黄连木遗传多样性相关参数[10]；使用分子变异方差分析（AMOVA）软件分析其遗传分化及遗传结构[11]。

2 结果与分析

2.1 雌黄连木AFLP遗传多样性分析

利用EA11MC1～EA11MC15、EA12MC1～EA12MC15、EA13MC1～EA13MC15、EA15MC1～EA15MC15、EA16MC1～EA16MC15引物组合的方式对雌黄连木基因池进行扩增。筛选出10对条带清晰的引物组合，对5个不同地区的总计139份黄连木雌株的DNA样品进行遗传多样性研究。表2显示：10对引物的香农指数（I）最大为0.608 6（EA11-MC14），最小为0.284 6（EA13-MC12），平均值为0.492 7；观测等位基因数（Na）最大值为2.000 0个，最小值为1.666 7个，平均值为1.876 0个；有效等位基因数（Ne）最大为1.772 8个（EA11-MC14），最小值为1.342 8个（EA13-MC12），平均值为1.592 6个；Nei基因多样性指数He最大值为 0.422 5（EA11-MC14），最小值为0.190 6，平均值为 0.335 3。

通过对2个地区5个雌黄连木种群的遗传多样性分析显示，在种群水平上长葛地区和安阳监狱雌黄连木种群的几项遗传多样性指数均高于其他种群。5个种群的平均遗传多样性指数分别为Na=1.173 2，Ne=1.482 4，He=0.273 2，I=0401 0（表3）。

Neis多样性指数He可以显示各个种群的变异程度，由表3可见，长葛地区雌黄连木种群变异程度最高（0.338 8），南沟（西后凹）的种群变异程度最低（0.224 6）。从遗传多样性指数来看，长葛地区遗传多样性水平最高（Na=1.860 5，Ne=1.594 4，He=0.338 8，I=0.496 6）；南沟（西后凹）最低（Na=0.162 02，Ne=1.388 3，He=0.224 6，I=0.333 6）。

2.2 雌黄连木遗传分化

雌黄连木不同种群的遗传分化程度见表4，所得数据经POPGEN 分析表明， 本试验中所调查的5个雌黄连木种群的总基因多样性（Ht）为0.321 8，种群内基因多样性（Hs）为 0.273 3，种群间遗传分化系数（Gst）为0.150 8，表明雌黄连木种群间分化程度属中度[12]。这与AMOVA的分析结果一致，即遗传变异的85.25%发生在种群内，种群间占14.75%。以上二者结论都表明，雌黄连木遗传变异主要发生在种群内。种群间的遗传分化在0.001水平上达到显著水平，种群间基因流Nm为2.814 9（Nm>1），说明种群间基因流水平较高，遗传分化较小。

2.3 雌黄连木遗传距离与相似度

通过对不同种群的雌黄连木的遗传距离与相似度分析可知，遗传距离最小的为长葛种群和安阳监狱种群，遗传距离最大为南沟（东后凹）种群和南沟（西后凹），范围在0.041 2～0.126 9之间。遗传相似度最高的为长葛种群和安阳监狱种群，最低的为南沟（东后沟）种群和南沟（西后凹）种群，遗传相似度范围在0.880 8～0.959 6之间（表5）。

3 讨论

基因变异，即遗传资源基因的丰富程度，是生物遗传多样性的最直接的表现形式。本研究利用10对AFLP引物对河南省2个地区5个不同种群遗传多样性进行了分析，由结果可知：I=0.492 7、Ne=1.592 6、He=0.335 3，这个结果表明，黄连木雌株遗传多样性处于中等水平，与王超等利用随机扩增微卫星多态性（RAMP）对黄连木进行遗传多样性研究的结果（I=0.380 3）[13]和吴志庒等利用简单重复序列（SSR）对黄连木天然种群遗传多样性的研究结果（He=0.472）[14]相近；而低于郝丽娟利用SSR（He=0.545 8）对黄连木天然种群遗传多样性的研究结果[15]。导致AFLP、SSR标记结果存在差异的原因可能有以下几点：（1）这2种分子标记技术的靶位点不相同，灵敏度不同，在分析过程中检测到的遗传信息不在同一位点，故导致结果不一致，但对于未知基因，AFLP技术检测位点多，获得更强的多态信息，结果更为准确[15]；（2）经过长期人工栽培，由于人工或自然选择等因素使得雌黄连木产生了许多变异，从而使单纯雌株的遗传多样性低于整个物种；（3）研究对象的取材地点和方法不一样，造成结果有差异。在种群水平上，不同的黄连木雌株种群内遗传多样性水平也呈现出一定的差异。5个种群中长葛地区的遗传多样性最高，而南沟（东后凹）种群多样性则最低。造成该结果的原因可能是各个种群所在地点不同，所存在的生态因子有一定差异，从而造成种群间遗传多样性有差异。

遗传分化，即遗传结构变异的分布格局的差异，是遗传多样性的重要体现，Gst值是反映种群进化历史的重要指标，基因流Nm则是影响遗传结构均质化的重要因子。在本研究中，5個不同黄连木雌株种群之间的遗传分化系数Gst=0.150 8，所以种群间变异程度为15.08%，种群内遗传变异程度为84.92%。该结果与众多风媒传粉的树种变异模式一致[16]。本研究由Gst计算的种群间基因流Nm为2.814 9，可能发挥均质化作用[17]，使得黄连木种群间遗传分化程度较低。

参考文献：endprint