亚甲基四氢叶酸还原酶MTHFR基因C677T多态性与食管癌预后的关系

刘芳+谭榜宪+彭小东+杜国波+蒋琳

【摘要】 目的：旨在探討亚甲基四氢叶酸还原酶MTHFR基因C677T多态性与食管癌生存期的关系。方法：收集155例在川北医学院附属医院确诊的食管鳞癌患者，调查患者的生活习惯并收集病理资料，采用限制性片段长度多态检测（PCR-RFLP）的方法检验研究对象的MTHFR基因型，使用Pearon 字2检验评估MTHFR基因C677T多态性与食管癌患者性别、年龄、吸烟、饮酒、食用水果习惯、病变长度等临床资料及病理特点之间的关系。用Kaplan-Meier方法和Cox回归模型分析基因型与患者总生存时间之间的相关性。结果：携带MTHFR三个不同基因型（突变型、野生型、杂合型）的总生存时间比较差异无统计学意义（P=0.462），而淋巴结转移阳性食管癌患者的总生存时间比较明显短于淋巴结转移阴性者（P=0.000），TNM分期Ⅲ期食管癌患者的总生存时间明显短于Ⅲ期以下者（P=0.002）。多变量Cox回归分析发现淋巴结转移、TNM分期是影响食管癌生存时间的独立风险因素（P<0.05），而性别、年龄、吸烟、饮酒、水果习惯、UGIC史、病变长度、首发症状、病变长度、MTHFR基因C677T多态性与食管癌的预后无关。结论：MTHFR基因C677T单核苷酸多态性可能与食管癌患者的预后无关，淋巴结转移和TNM分期可以提示预后。

【关键词】 食管癌； 多态性； MTHFR； 预后

【Abstract】 Objective：To discuss the relationship between methylenetetrahydrofolate reductase（MTHFR） C677T polymorphism and the prognosis of esophageal cancer.Method：A total of 155 patients with esophageal squamous cell carcinomas which were diagnosed in Affiliated Hospital of North Sichuan Medical College.Survey patients' habits and collect their pathological data.MTHFR C677T polymorphism in these patients were determined by Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length Polymorphism（PCR-RFLP）methods.Pearon chi-square was used to discuss the relationship between MTHFR gene C677T polymorphisms and the clinical data and pathological characteristics，such as patients gender，age，smoking，drinking，eating fruit habits，length of lesion and so on.Kaplan Meier method and Cox regression model were used to analyze the correlation between genotypes and total survival time of patients.Result：Overall survival（OS） of patients with MTHFR gene C677T mutation type TT，OS of patients with wild type CC and MST of patients with hybrid type CT were not significant different（P=0.462）.OS of patients with lymph node metastasis was lower than that with negative lymph node metastasis（P=0.000）.OS of patients in stage Ⅲ was significantly was lower than that of below stageⅢ（P=0.002）.Cox multivariate analysis showed that lymph node metastasis and TNM stage were risk factors influencing survival（P<0.05）.However，gender，age，smoking，drinking，habits of fruit，UGIC history，length of lesion，original symptom and MTHFR C677T polymorphisms were not related to the prognosis of patients with esophageal cancer.Conclusion：Polymorphisms of MTHFR C677T may have nothing to do with the prognosis of patients with esophageal cancer.Lymph node metastasis and TNM stage may be potential prognostic factors to esophageal cancer patients.

【Key words】 Esophageal cancer； Polymorphisms； MTHFR； Prognosis

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2017.20.001endprint

我国是世界上食管癌发病率和死亡率最高的国家，在中国十大恶性肿瘤死亡率中，食管癌死亡率居第四位，中国食管癌死亡人数占全球的51.7%[1]，我国90%以上为鳞状细胞癌。2012年，全球大约有456 000例新发病例和400 000例死亡病例，其中约半数的病例发生在中国[2-3]。手术治疗是食管癌的主要治疗手段之一，但食管癌预后差，中晚期患者治疗后5年生存率不足20%[4]。临床中常常发现即便是相同的病理类型和分期的患者接受相同的治疗方案后，其治疗后生存率仍存在巨大的差异，提示个体的遗传因素可能在食管癌治疗效果和预后等方面起着重要的作用。

MTHFR是叶酸代谢和DNA甲基化过程中的限速酶，MTHFR基因在人群中具有高的单核苷酸多态性（SNP），其中最常见的是677位点上C→T的改变。该突变导致丙氨酸转化为缬氨酸，从而导致酶的活性改变[5]。SNP作为一种常见的遗传变异，可导致个体表型的差异以及不同个体对疾病的易感性，以及对环境因素和药物及治疗反应的差异。MTHFR677C-T多态性与患者的预后的关系在不同类型的恶性肿瘤有不同的结果[6-8]。有研究发现，结直肠癌、乳腺癌、非霍奇金淋巴瘤、肺癌、胃癌、食管癌等肿瘤的预后可能与MTHFR基因多态性有关[9]。本研究拟通过分析MTHFR677多态性与食管癌手术治疗患者预后生存的相关性，探讨影响食管癌预后的因素，为食管癌治疗效果的评估提供参考，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 从2012年8月开始收集川北医学院附属医院胸外科确诊为食管鳞癌患者共155例。从手术之日开始随访，随访截止时间为2015年9月。所有研究对象均自愿参加调查，并在确诊后接受面对面的流行病学问卷调查。吸烟定义为每天至少一支，持续6个月以上。饮酒定义为每周饮用至少一次并持续6个月以上[10]。食用水果习惯定义为每日摄入水果至少一次并持续1年以上。将有一名以上一级亲属和/或两名以上二级亲属患食管癌/贲门癌/胃癌的患者定义为上消化道肿瘤（upper gastrointestinal cancer，UGIC）家族史阳性[11]。患者在手术前采用真空抗凝采血管收集外周静脉血5 mL，-80 ℃超低温冰箱长期保存用于基因组DNA提取。所有患者术前均未行过放疗、化疗等抗肿瘤治疗，所有患者术前进行全面检查排除远处转移，手术方式为食管切除和区域淋巴结清扫，食管胃胸顶或颈部吻合，常规清扫的淋巴结：气管隆突下淋巴结、食管旁淋巴结、左下肺静脉淋巴结、左下肺韧带淋巴结、左肺动脉淋巴结、贲门旁淋巴结和胃周淋巴结。

1.2 MTHFR基因C677T多态性分析 采用聚合酶链式反应-限制性片段长度（PCR-RFLP）的方法进行基因多态分析，MTHFR基因C677T位点的PCR引物序列，上游引物‘TGAAGGAGAAGGTGT CTG CGG GA，下游引物‘AGGACGGTGCGGTGAGAGTG[12]，25 μL扩增反应体系中包含12.5 μL Go Taq Green Master Mix 2×，2.5 mL DNA模板，8 μL Nuclease-Free Water和引物各1 μL，反应条件为94 ℃预变性2 min，94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循环34次，最终72 ℃延伸7 min，产物为194 bp。然后取5 μL PCR产物，加入9 mL Nuclease-Free Water，1 μL 10×Buffer Tango，1 μL限制性内切酶Hinf I限制性内切酶，建立16 μL的反应体积，混匀后离心9 s，置于37 ℃水浴箱中水浴孵育12 h。酶切反应结束后，取8 μL酶切产物，加样于已混有Goldview染色剂3%琼脂糖凝胶中电泳（100 V电压，1×TAE电泳缓冲液）40 min，待电泳结束后，以凝胶成像分析仪观察分析电泳结果。突变基因型TT有两个条带（175 bp and 23 bp），杂合基因型CT有三个条带（198 bp，175 bp and 23 bp），野生型CC有一个条带198 bp，由于23 bp条带太小无法显示，见图1。

1.3 统计学处理 使用Pearon 字2检验评估3个位点基因型分布同食管癌患者性别、年龄、城市农村、UGIC家族史、首发症状等临床资料及病理特点（肿瘤病变长度、淋巴结转移与否、TNM分期）的关系。使用Kaplan-Meier法进行单因素生存分析，通过log-rank检验比较不同生存率间的差异。使用Cox回归模型校正年龄、性别、吸烟、饮酒、分化程度等因素进行多因素生存分析。本次研究的数据统计分析使用SPSS 20.0软件包完成，所有统计学检验均是双侧的，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 研究对象基本特征 155例食管鳞癌患者，男95例（61.3%），女60例（38.7%），年龄38～82岁，平均（61.79±7.35）岁，中位年龄62岁。所有研究对象均行手术治疗，且有明确的术后病理报告记录。到生存随访截止时间为止，63例死亡，2例失访，中位生存期为35.11个月。

2.2 MTHFR基因型与食管癌的关系 本研究将患者分为男性组和女性组，比较MTHFR三个基因型在两组间的差异，结果发现MTHFR突变基因型（TT）和杂合基因型（CT）在男性组的比例略高于女性组，但差异无统计学意义（P=0.299）。进一步将TT和CT两个基因型合并后分析，差异无统计学意义（P=0.102）。155例患者中，年龄大于60岁者85例，60岁及以下者共70例，三个基因型在两组间分布差异无统计学意义（P=0.361）。农村患者占本研究的83.9%，但是城市食管癌患者和农村食管癌患者在MTHFR基因型的分布差异无统计学意义（P=0.228）。155例患者中，55.5%的患者有吸烟史，饮酒者占46.5%，未发现吸烟、饮酒组的MTHFR基因型比较差异有统计学意义（P<0.05）。还调查了患者食用水果的习惯，研究发现有食用水果习惯的患者占了大多数（66.5%），MTHFR三个基因型在两组间差异无统计学意义（P>0.05）。但是，将TT和CT两个基因型合并后分析，发现含突变基因的基因型在无食用水果习惯组的比例更高，差异有统计学意义[P=0.04，95%CI（1.052，4.071）]。根据食管癌患者术后病例报告，发现155例患者中，67例淋巴结转移阳性患者，88例淋巴结转移阴性者。根据有无淋巴结转移，将食管癌分为两组来比较MTHFR基因型的差异，差异无统计学意义（P=0.657）。本研究数据显示，食管癌病变长度从1～9 cm不等，分为≤4 cm和>4 cm，研究发现MTHFR基因型在两者间分布差异无统计学意义（P=0.322）。根据2009年UICC的TNM分期，155例患者中，0期4例，Ⅰ期27例，Ⅱ期30例，Ⅲ期94例，Ⅳ期0例。將其分为Ⅲ期以前61例，Ⅲ期94例，两者MTHFR基因型分布上差异无统计学意义（P=0.714）。见表1～2。endprint

2.3 生存分析结果 155例入组患者的中位生存时间为35.11个月，男性、女性总生存时间比较差异无统计学意义（P=0.985），年龄≤60岁和>60岁总生存时间比较差异无统计学意义（P=0.392），城市、农村患者总生存时间比较差异无统计学意义（P=0.200）。由表3可知，吸烟、饮酒患者的总生存时间分别短于不吸烟、不饮酒，但差异均无统计学意义（P>0.05）。有无水果习惯总生存时间比较差异无统计学意义（P=0.559）。研究有无UGIC史生存期发现，有UGIC史患者总生存时间短于无UGIC史患者，但差异无统计学意义（P=0.395）。吞咽困难者与其他表现者生存状况比较，差异无统计学意义（P=0.196）。病变长度≤4 cm和>4 cm总生存时间比较，差异无统计学意义（P=0.617）。本研究发现，有淋巴结转移食管癌患者的中位生存时间为33个月，无淋巴结转移者中位生存时间为35个月。无淋巴结转移者的生存期明显长于有淋巴结转移者，差异有统计学意义（P=0.000），生存曲线见图2。而TNM分期在Ⅲ期以前的食管癌患者总生存时间短于Ⅲ期食管癌患者，差异有统计学意义（P=0.002），生存曲线见图3。最后研究MTHFR三个基因型TT、CT、CC总生存时间均为35个月，三组的总生存期比较差异无统计学意义（P=0.462）。进一步采用Cox回归模型校正年龄、性别、吸烟、饮酒、分化程度等因素进行多因素生存分析，因为淋巴结转移和TNM分期存在相互影响，因此，将其分开纳入方程，结果发现淋巴结转移和TNM分期均是影响食管癌生存时间的独立风险因素（P<0.05）。

3 讨论

目前认为影响食管鳞癌患者预后的因素众多，但还没有一致的结论，主要包括TNM分期和患者一般状况，如性别、年龄、家族史、体重指数、活动状态（PS）评分和病变长度等。有研究发现高低发区、城市农村、肿瘤家族史、肿瘤部位、大体类型、分化程度对食管癌患者的预后影响，差异均无统计学意义（P>0.05），但是性别、诊断年龄与食管癌患者的预后有关。女性食管癌患者的中位生存期要大于男性（P<0.05），≤50岁的食管癌患者中位生存期大于50岁以上的患者（P<0.05）[14]。魏栋[15]学者研宄结果显示年龄是食管癌患者预后的独立影响因素，但是该研究发现青年组食管癌生存率低于老年组。有研究认为食管原发灶长度是食管癌预后重要指标[16]。Griffiths等[17]的研究显示长度超过3.5cm的食管癌病变预后较差。Wang等[18]的研宄表明肿瘤长度是预后的独立预测指标，肿瘤长度>4cm的食管癌患者总生存期缩短 。有一部分学者认为肿瘤的位置与食管癌的预后有关[19-21]。不过，也有研究持不同意见，一项大样本研究结论认为性别、肿瘤部位与食管癌的预后无关，淋巴结转移、远处转移、T分期与食管癌的预后有关[22]。一项针对中国的食管鳞癌研究认为，临床因素如性别、年龄、吸烟、饮酒与食管鳞癌的预后无关。进一步研究认为食管鳞癌的部位（上段、中段、下段）与食管癌的预后无关，但是食管癌淋巴结转移与否、有无远处转移、临床分期与食管癌的预后有关。临床分期3～4期的死亡率38%，明显高于1～2期的死亡率20%（P<0.001）[23]。这与本研究的结论一致。本研究认为性别、年龄、吸烟、饮酒、水果习惯、UGIC史、首发症状、病变长度与食管癌的预后无关，而淋巴结转移、TNM分期与食管癌的预后有关。可见，影响食管癌的因素很多，且不同的研究结果差异很大，这可能与样本量的多少，食管癌的地域分布差异有关。而且，大多数临床资料的收集都属于回顾性收集，当患者确诊后可能存在生活习惯的改变，最终导致研究结果的差异。但是，绝大多数研究都认为淋巴结转移与否，TNM分期与食管预后有关。TNM分期是一个综合分期，既考虑了原发灶的因素，也考虑到淋巴结侵犯和远处转移的情况，TNM分期是判断预后的最重要的因素，在临床上有十分重要的意义。因此，临床工作中，准确的分期能够为治疗方案的优化、判断预后提供标准。

目前有大量的研究讨论MTHFR677位点的基因多态性与食管癌的易感性的关系。然而，MTHFR677位点的基因多态性与食管癌的预后的研究却很少，且存在争论[24-26]。 Sarbia 等[24]和Wu等[25]研究认为MTHFR677C-T多态性与食管鳞癌的预后有关。也有研究针对以5-Fu为基础化疗的食管癌患者认为，突变基因型TT存在生存获益[27-28]。但是，一项在中国开展的食管鳞癌研究认为MTHFR677位点的基因多态性与食管癌的预后无关。本研究也未发现MTHFR677位点的基因多态性与食管癌的预后有关。有学者对印度北部人群的研究也没有发现MTHFR677C-T多态性与食管鳞癌的预后有关[29]。一项对英国人群的分析同样认为MTHFR基因型对食管癌的生存期没有影响[30]。研究發现，MTHFR677C-T多态性在不同的人群中有很大程度的差异[31]。因此，不同种族，不同地区研究结果的不同，很大程度上是因为基因多态性的人群分布差异。

因此，期待更多大样本、多中心的前瞻性研究来进一步探讨影响食管癌的预后因素，同时开展更多MTHFR677C-T多态性与食管癌预后的研究，为食管癌的个体化精准治疗提供参考。

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