腹泻仔猪中猪圆环病毒2型的检测及生物信息学分析

平 措 ， 许思遥 ，徐志文 ，朱 玲

（1．四川农业大学动物医学院，四川 成都 611130；2．西藏林芝市巴宜区农牧局兽防站， 西藏 林芝 860100）

腹泻仔猪中猪圆环病毒2型的检测及生物信息学分析

平 措1，2， 许思遥1，徐志文1，朱 玲1

（1．四川农业大学动物医学院，四川 成都 611130；2．西藏林芝市巴宜区农牧局兽防站， 西藏 林芝 860100）

为研究仔猪腹泻中猪圆环病毒2型(PCV2)的生物信息，参考GenBank发表的猪圆环病毒2型(PCV2)全基因组序列，设计并合成一对特异性引物，从四川地区猪场送检的腹泻仔猪病料中扩增PCV2全长基因序列，回收PCR产物。将其插入PMD19-T载体，构建了重组质粒，转化后筛选、提取阳性重组质粒进行测序。将测序结果及推导的氨基酸序列与国内外的不同分离株进行生物信息学分析。结果表明，分离株基因组全长为1 767 bp，分离的三株基因组与GenBank上已发表的PCV2分离株之间的核苷酸同源性分别为1#94．7%～89．6%、2#94．7%～89．3%、3#96．4%～86．8%，氨基酸序列同源性为1#97．9%～95．7%、2#97．1%～95．5%、3#98．4%～94．8%，说明四川地区腹泻仔猪病料中PCV2的变异相对保守。

猪圆环病毒2型；PCR检测；生物信息学分析

圆环猪病毒（porcine circovirus，PCV）在1974年首次由德国学者Tischer在PK-15细胞培养污染物中分离得到[1]，在分类学上属圆环病毒科圆环病毒属，它是一种无囊膜的单股负链环状DNA病毒，为已知的最小的动物病毒之一。病毒粒子直径14～17 nm，呈20面体对称结构，无囊膜，含有共价闭合的单股环状负链DNA，基因组大小约为1.76 kb。PCV对外界理化因子的抵抗力相当强，即便在pH3的酸性环境及72 ℃的高温环境中也能存活一段时间，氯仿作用不失活，无血凝活性[2，3]。致病性和核酸序列的不同，分为1型(PCV1)和2型(PCV2)[4]，近期有报道发现3型(PCV3)[5]。PCV1基因组长1 759 bp，PCV2基因组长1 767～1 768 bp，PCV3基 因 组长2 000 bp。研究发现，PCV2含有11个ORFs，有两个主要即ORF1和ORF2[7]。ORF1编码复制酶相关的rep蛋白，该蛋白氨基酸序列相当保守，是与PCV1产生抗原交叉性的主要部位；ORF2编码病毒的核衣壳蛋白[8，9]。PCV2和PCV1、PCV3间氨基酸序列同源性较低，差异较为明显[10]。猪对PCV2具有较强的易感性，感染猪可自鼻液、粪便等代谢废物中排出病毒，经口腔、呼吸道途径感染不同年龄的猪。

PCV2为致病性的病毒[11]，是断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）、猪皮炎肾炎综合征(PDNS)、仔猪先天性震颤（CT）、增生性坏死性肺炎（PNP）、猪呼吸道疾病综合征（PRDC）、繁殖障碍、肠炎等多种疾病的病原[12]。腹泻是猪的一种常见病，发病率高，常发病于冬春、夏秋的交替期。近年仔猪冬季腹泻情况多发，并且仔猪腹泻表现为发病率高，致死率高的整体情况。近年全国范围内仔猪腹泻发病率高、死亡率高，造成较大经济损失，已成为影响我国养猪产业发展的一大障碍。猪腹泻中仔猪腹泻占总量的比重较大，多发于1～3月龄的断奶仔猪，腹泻引起的死亡占仔猪死亡总数的40%。低日龄仔猪感染PCV2后继发感染其他病原报道时有发生，尤其以腹泻为典型临床特征的病例更是常有报道，血清学调查表明，PCV在世界范围内流行[13]。圆环病毒（PCV）被列为世界公认的当前危害养猪业发展的头号疫病[14，15]，已引起世界各国的广泛关注。这次实验通过PCR方法在仔猪腹泻病料中克隆PCV2全基因，并与GenBank中的参考序列比较分析，有助于了解不同地区的PCV2毒株序列的同源性差异，为仔猪腹泻病料中PCV2的分子生物学及分子流行病学调查提供数据支持。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验病料

病料的采集：病料主要来源2016年10月至2017年6月四川地区某猪场送检腹泻仔猪组织样品，采集患腹泻的死猪的病料组织样品进行检测。

PCV2阳性病料由四川农业大学生物技术中心保存并提供。

病料的处理：采取剖解猪的腹股沟淋巴结、脾脏、肺脏、肝脏等组织作为检测PCV2的材料，加入少许PBS溶液，-70 ℃反复冻融3次，在研钵中经行无菌研磨，4 ℃ 12 000 r/min离心5 min，取上清液备用。

表1 主要仪器

表2 DNA提取产物的PCR反应体系

1.1.2 实验试剂

DL2000 Marker、Marker III 购TIANGEN生物制品公司；2xTaq PCR master Mix 购 自 TaKa-Ra；氯仿，异丙醇，75%乙醇，TE；10 mg/mL EB JC存液：以l0 mg/mL浓度将EB溶于双蒸水中，剧烈搅拌，完全溶解后，室温下避光保存。

实验材料由四川农业大学生物技术中心提供。

1.1.3 主要仪器

主要仪器见表1。

1.1.4 引物的设计与合成

参照GenBank发表的PCV2全基因序列，通过Primer Premier 5.0生物软件设计出一对特异性引物。其序列如下：

1.2 方法

1.2.1 病料病毒DNA的提取方法

1）取病料研磨后取上清液离心（12 000 r/min×5 min） 后 去 400 μL上清液，加500 μL饱和酚后混匀静置5 min。

图1 PCV2基因的PCR电泳产物

2）再次离心（12 000 r/min×5min）后取上清液加入饱和酚、氯仿各200 μL， 混 匀 静 置 5 min后 离 心（12 000 r/min×5 min）

3）重复步骤2）。

4）再取上清液加入氯仿400 uL，混匀静置5 min后离心（12 000 r/min×5 min）。

5）离心后取上清液加入2倍体积异丙醇轻摇2 min后静置放入冰箱（-20 ℃）10 min，

6）取出离心（12 000 r/min×5 min）。离心后弃上清液，用75%的冰乙醇1 mL清洗沉淀及管壁后离心（12 000 r/min×5 min）。

7）离心后弃上清液，室温干燥沉淀。最后加入30～50 μL TE溶解干燥沉淀，放入-20 ℃保存。

1.2.2 DNA提取产物的PCR扩增

采用10 μL体系进行PCR扩增。PCR反应体系为（见表2）：

PCR反应程序为：预变性：95 ℃ 4 min、变性 ：95 ℃ 30 s、退火：52.8 ℃ 30 s、延伸：72 ℃ 30 s，反应35个循环、终延伸：72 ℃ 7 min，4 ℃保存。

表3 目的片段PCR反应体系

表4 国内外某些PCV2的登录号及来源

1.2.3 PCR扩增产物电泳将PCR产物加入制作好的琼脂糖凝胶孔中，采用DL 2000 marker，进行电泳。

1.2.4 凝胶成像及对照

利用凝胶成像仪成像，并对结果进行阴阳性对照。在电泳缓冲液中，5 V/cm电压，电泳30 min。最终获得长度约为1 767 bp的片段，与预期扩增的片段长度相符。

1.2.3 目的DNA片段的回收与连接

按照琼脂糖凝胶回收试剂盒说明书进行，取30～50μL的回收产物置-20 ℃备存。

将回收好的目的片段与PMD19-T simple Vector 连接，反应体系为（见表3）。

1.2.4 DH5α感受态细胞的制备

无菌条件下用挑取DH5α大肠杆菌多个菌落，接种于10 mL的LB肉汤中，37 ℃水浴振荡培养过夜，次日取1 mL DH5α菌液接种于20 mL的LB培养基中，37 ℃水浴振荡培养至OD 0.6左右，将菌液转移至15 mL离心 管， 冰 浴 10 min ，3 000 r/min ，离心5 min ，弃上清，将菌体悬浮在10 mL 0.1 mol/L CaCl2中，冰浴10 min，3 000 r/min，4 ℃ 离 心 5 min ，弃上清，将菌体重悬于10 mL 0.1 mol/L CaCl2，冰浴中放置12 h。

1.2.5 连接物的转化、阳性克隆菌落挑选和鉴定

取100 μL上述制备的感受态细胞，加入10 μL连接产物并搅拌混匀，先冰浴30 min，然后42 ℃水浴2 min ，再冰浴5 min，加入0.9 mL LB液体培养基，37 ℃水浴振荡1 h，将200 μL转化菌涂布于LB/Amp/X-Gal/IPTG 琼脂固体培养基，置37 ℃培养12 h，观察菌落生长情况，筛选出重组转化体。再将其接种于10 mL LB/Amp/X-Gal/IPTG液体培养基中，于37 ℃以220 r／min摇振培养过夜。用菌液PCR挑选出阳性克隆菌落。通过电泳检测，克隆的阳性重组质粒均带有相应的目的片段。检测为阳性，说明转化成功。

取菌落PCR鉴定为阳性的菌液送上海生工生物工程技术服务有限公司进行序列测定。

2 结果

2.1 PCV2基因核苷酸序列同源性分析结果

利用DNA Star，NCBI等软件拼接、比对，确定测序结果为PCV2。将所得序列与NCIBI数据库中收录的国内外部分PCV2基因序列（表4）进行核苷酸的同源性比较。

将本次实验获得的3株PCV2基因序列，与NCBI数据库里的十株PCV2基因和完整的PCV2基因序列，运用DNA Star软件进行同源性分析。

1号PCV2基因组与国外四株PCV基因组加拿大株（AF027217）、美国株（AY391927）、法国株（HM623764）和丹麦株（FJ935780）同源性分别为96.2%、97.7%、95.7%和 97.9%， 同源性相对较高且相差2.2%。在与国内6株PCV基因组浙江株（AY188355）（AY651850）、 北 京 株（AF381175）、南 京 株（AY556473）、 山 东 株（AY536755） 和 广 东 株（JX294717）的同源性在97.9%-96.1%之间，1号PCV2毒株与浙江株（AY188355）及山东株（AY536755）的同源性最高，达到97.9%。同源性最低的是北京株（AF381175），为96.1%。

2号PCV2基因组与国外四株PCV基因组加拿大株（AF027217）、美国株（AY391927）、法国株（HM623764）和丹麦株（FJ935780）同源性分别为96.1%、97.0%、95.5%和 97.1%， 同源性相对较高且相差1.6%。在与国内6株PCV基因组浙江株（AY188355）（AY651850）、 北 京 株（AF381175）、南 京 株（AY556473）、 山 东 株（AY536755） 和 广 东 株（JX294717）的同源性在97.1%-96.0%之间，1号PCV2毒株与浙江株（AY188355）及山东株（AY536755）的同源性最高，达到97.9%。同源性最低的是北京株（AF381175），为96.0%。

图2 PCV2基因核苷酸序列同源性比较

图3 PCV2基因推导氨基酸同源性比较

图4 PCV2推导氨基酸的遗传进化树（最大似然法）

图5 PCV2推导氨基酸的遗传进化树（相似临界法）

3号PCV2基因组与国外四株PCV基因组加拿大株（AF027217）、美国株（AY391927）、法国株（HM623764）和丹麦株（FJ935780）同源性分别为95.1%、96.0%、94.8%和 96.3%， 同源性相对较高且相差1.5%。在与国内6株PCV基因组浙江株（AY188355）（AY651850）、 北 京 株（AF381175）、南 京 株（AY556473）、 山 东 株（AY536755）和广东株（JX294717）的同源性在98.4%～95.0%之间，1号PCV2毒株与南京株（AY556473）的同源性最高，达到98.4%。同源性最低的是北京株（AF381175），为95.0%。

1、2、3号的相互同源性比较相近，在97.7%～96.3%之间。

通过以上核苷酸同源性比较，可以看出，三株与国内基因组进行同源性比较与北京株（AF381175）同源性最低。浙江株（AY188355）（AY651850）的同源性比较相同，可以看出PCV2在进化上比较保守的这一特性。

2.2 PCV2基因推导氨基酸的生物信息学分析结果

PCV2均含有11个ORF区域，有2个主要即ORF1和ORF2。ORF1编码复制酶相关的rep蛋白，ORF2编码病毒的核衣壳蛋白。本试验筛选PCV2基因的ORF1，获得的核苷酸序列利用MEGA软件推导出氨基酸序列，同时推导出上述NCBI数据库里的十株PCV2基因的氨基酸序列，并利用DNA-start软件进行同源性分析，得出以下结果。

1号PCV2基因组与国外四株PCV基因组加拿大株（AF027217）、美国株（AY391927）、法国株（HM623764）和丹麦株（FJ935780）同源性分别为91.3%、94.6%、89.6%和 94.7%， 同源性相对较高且相差5.1%。在与国内6株PCV基因组浙江株（AY188355）（AY651850）、 北 京 株（AF381175）、南 京 株（AY556473）、 山 东 株（AY536755） 和 广 东 株（JX294717）的同源性在94.7%-91.9%之间，1号PCV2毒株与浙江株（AY188355）及山东株（AY536755）的同源性最高，达到94.7%。同源性最低的是南京株（AY556473），为91.9%。

2号PCV2基因组与国外四株PCV基因组加拿大株（AF027217）、美国株（AY391927）、法国株（HM623764）和丹麦株（FJ935780）同源性分别为90.0%、92.0%、89.3%和 92.2%， 同源性相对较高且相差2.9%。在与国内6株PCV基因组浙江株（AY188355）（AY651850）、北京 株（AF381175）、南 京 株（AY556473）、 山 东 株（AY536755）和广东株（JX294717）的同源性在94.7%～90.0%之间，1号PCV2毒株与南京株（AY556473）的同源性最高，达到94.7%。同源性最低的是北京株（AF381175），为90.0%。

3号PCV2基因组与国外四株PCV基因组加拿大株（AF027217）、美国株（AY391927）、法国株（HM623764）和丹麦株（FJ935780）同源性分别为87.1%、89.8%、86.8%和 90.3%， 同源性相对较高且相差3.5%。在与国内6株PCV基因组浙江株（AY188355）（AY651850）、 北 京 株（AF381175）、南 京 株（AY556473）、 山 东 株（AY536755）和广东株（JX294717）的同源性在96.4%～87.1%之间，1号PCV2毒株与南京株（AY556473）、的同源性最高，达到94.7%。同源性最低的是北京株（AF381175），为91.9%。

1、2、3号的相互同源性比较相近，在93.7%～90.3%之间。

通过以上核苷酸同源性比较，可以看出，三株推导出的氨基酸序列与南京株（AY556473）的同源性最高，与国外株法国株（HM623764）同源性最低，且都在90%以下。

2.3 PCV2基因推导氨基酸遗传进化树分析结果

将有核苷酸序列推导的氨基酸序列利用MEGA软件分析，采用Poisson模型分别使用最大似然法和相似临界法重复1 000次进行建树分析，获得下列进化树。

在绘制的两幅进化树中可以看出，PCV2分成3个独立的大群，1号PCV2基因组与2号、3号PCV2基因组不在一个大群，2号、3号PCV2基因组在一个大群。2号PCV2基因组和3号PCV2基因组在同一大群的不同亚组。并且2种不同的方法进行分析得出的分组情况一致，相互印证，说明进化树稳定。

3 讨论

目前通过已知病毒株的基因序列来扩增获得流行株对应基因序列，并使用软件分析核苷酸组成的DNA序列和蛋白质组成的氨基酸序列的同源性差异，来判断目的基因的变异情况己经成为病毒基础研究中重要且常用的手段和方法[8]。通过对流行株序列相关分析，监测流行株的变异情况及趋势，提前做出预防措施对于生猪养殖有重要意义。

仔猪腹泻情况多发，可由多种原因引起，通过对仔猪腹泻病料中PCV2的检测及生物信息学分析，可以看出PCV2在进化上相对比较保守，但随着流行时间的增加也逐渐发生了变异，这些变异是否能导致毒力发生变化尚不明确。至今为止，虽然PCV2的研究已经取得了很大的进展，但是PCV2病毒的来源和致病机制尚不十分明确。并且当前不同国家和不同临床病症下分离到的PCV2毒株间的致病性有何差异也暂不清楚，对PCV2病毒的变异也处在探索阶段。因此，对PCV2毒株基因组序列差异开展研究，有助于阐明疫病暴发的真正原因，从而控制疫病，减少损失。

本研究克隆的3株PCV2毒株，基因组大小均为1 767 bp，与本次实验分析的其他PCV2毒株全基因组核苷酸序列同源性分型分别在在1#94.7%～89.6%、2#94.7%～89.3%、3#96.4%～86.8%之间，氨基酸序列同源性在1#97.9%～95.7%、2#97.1%～95.5%、3#98.4%～94.8%之间，说明三株PCV2 毒株与国内外已报道的PCV2分离株的相对同源性较高，PCV2毒株间的亲缘关系很近，符合PCV2不同分离株间在遗传上比较保守这一特性，同现阶段对PCV2病毒的研究成果相印证。但是分析结果，也可以看出尽管遗传保守，但也存在着变异，并且变异的发生同地理位置分布有一定程度上的相关性。

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四川省科技支撑计划(2014NZ0043;2015NZ0072)

主要作者：平措，1975年，男，藏族，西藏林芝，中级兽医师，动物检疫专科，主要从事兽医方向研究

2017-06-27）