冬凤兰组织培养与快繁技术研究

董晓娜++徐佩玲++陈培++杜丽敏

摘 要 通过探索冬凤兰的组培技术，为冬凤兰的保护和工厂化生产提供技术支撑。以冬凤兰蒴果为原材料，通过不同激素对比，筛选适宜萌芽培养基，并开展了冬凤兰增殖扩繁、生根壮苗、移栽驯化等一系列研究。结果表明：在培养基MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L+CM 15%上，萌发时间最早，萌芽率较高；在改良VW培养基上芽分化效果较MS培养基好，芽分化率高，生长势好；在生根培养基VW+IBA 0.5 mg/L+NAA 1.0 mg/L+卡拉胶10 g/L+活性炭0.4 g/L上，生根率达100%；冬凤兰后期需要采用630或650 mL的组培瓶。

关键词 冬凤兰 ；VW培养基 ；组织培养 ；快速繁殖

中图分类号 S682.31 文献标识码 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2017.10.012

Tissue Culture and Rapid Propagation of Cymbidium dayanum

DONG Xiaona XU Peiling CHEN Pei DU Limin

（Forestry Research Institute of Hainan Province， Haikou， Hainan 571100）

Abstract Tissue culture was conducted to provide technical support to conservation and mass production of Cymbidium dayanum. Capsules of C. dayanum were used as material and cultured for plant regeneration. Different hormones were tried in the MS mediums to select a suitable germination medium. The germinated capsules were then cultured for proliferation， rooting， formation of strong rooted plantlets and transfer. The results showed that the capsule germinated the earliest with the highest germination rate when cultured in the MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L+CM 15% medium， that the bud differentiation was higher in the improved VW medium than in the MS， with higher growth vigor， that the rooting rate was 100% when the plantlets were cultured in the rooting medium VW+IBA 0.5 mg/L+NAA 1.0 mg/L+carrageenan10 g/L+0.4 g/L， and that the rooted plantlets were then transferred into tissue culture bottles with the bottle size of 630/650 mL.

Keywords Cymbidium dayanum ； VW medium ； tissue culture ； rapid propagation

冬鳳兰（Cymbidium dayanum Rchb. f.）为附生兰，生于海拔300～1 600 m的疏林中树上或沿溪谷旁岩石壁上。海南主要产地为陵水、琼中、白沙等地。冬凤兰总状花序具5～9朵花；花葶侧生，下垂或外弯；萼片和花瓣白色至奶油黄色，中央有1条粟褐色纵带（从基部到上部3/4处），或偶见整个瓣片充满淡枣红色，唇瓣栗色，但褶片和中央裂片为白色；冬凤兰花期为8～12月份[1]。冬凤兰花期持久，株型优美，具有极大的观赏价值。罗远华等[2]采用灼烧法对冬凤兰蒴果进行灭菌处理，认为此法不用杀菌剂且操作简便，是冬凤兰种子理想的灭菌方法。林泋君[3]以澳大利亚进口的冬凤兰花梗中部为外植体进行试管繁殖。目前针对冬凤兰的研究相对较少。本研究通过常规升汞消毒的方法处理蒴果，将种子无菌播种于MS培养基，通过不同激素诱导出原球茎或芽后，采用改良VW和MS 2种培养基进行原球茎或芽的分化培养，并以改良VW培养基为基础培养基开展扩繁、生根培养研究，探索冬凤兰的组织培养技术，为其工厂化生产提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

冬凤兰的蒴果来源于海南省林业科学研究所野生兰花种质资源圃内。试验在海南省林业科学研究所生物技术研究室进行。以八九成熟的自交蒴果为供试材料，从蒴果中收集种子作为外植体进行种子的无菌播种。

1.2 方法

1.2.1 材料处理

取八九成熟的尚未裂开的蒴果为外植体；在超净工作台上，切除蒴果的果梗，用75%酒精棉球擦去表面的脏物后，将其浸泡在75%酒精中30 s，然后用无菌水冲洗2～3次后，再用0.1%升汞溶液消毒15 min，并不时振荡，最后用无菌水冲洗5～6次，每次5 min；将消毒好的蒴果放于无菌接种盘中，用消毒刀将蒴果切开后即可播种。

1.2.2 种子萌发培养

以MS为种子萌发的基本培养基，分别添加6-BA（0.5、1.0 mg/L）+NAA 0.5 mg/L组合，并添加白糖30 g/L、卡拉胶10 g/L，CM 15%，具体见表1，pH 5.7。endprint

1.2.3 原球茎增殖

诱导出原球茎或芽后，为在短时间内获得大量组培材料，本研究采用液体振荡的方式。增值培养基为改良VW培养基，添加6-BA 1.0 mg/L，并附加白糖30 g/L，活性碳0.4 g/L，pH 5.7。增殖率采用称量法进行统计，增殖率=（接入原球茎振荡培养20 d后组培瓶重-接入原球茎初组培瓶重）×100%。

1.2.4 原球茎分化

分别采用MS和改良VW 两种基本培养基，添加6-BA 1.0 mg/L、NAA 0.5 mg/L，并附加白糖30 g/L、卡拉胶10 g/L、活性炭0.4 g/L，调节pH为5.7，对原球茎进行分化培养。每处理接种10瓶，3个重复，培养40 d后统计原球茎的分化率。原球茎分化率=（分化出茎叶的原球茎数/接种原球茎数）×100%。

1.2.5 生根培养及移栽

将分化出茎叶的原球茎切去单芽后接种于壮苗生根培养基VW+IBA 0.5 mg/L+NAA 1.0 mg/L+卡拉胶10 g/L+活性炭0.4 g/L中进行生根诱导。

后期将组培苗移入630 或650 mL的组培瓶中，待苗高10～11 cm、叶3～5片、根数3～6时即可移栽。移栽前首先要将组培瓶移入兰花棚中不开盖炼苗15～30 d后，再开盖炼苗至少3 d；炼苗后将苗取出，洗净根上的培养基，用多菌灵溶液浸泡消毒并晾干，移栽入组培盘内。

1.2.6 培养方式及培养条件

采用固体培养基培养的方式，早期以220 mL的组培瓶为培养容器，每瓶培养基用量为30～40 mL；后期采用630或650 mL的组培瓶为培养容器，每瓶培养基用量为100 mL左右，pH值5.7。除种子无菌播种时需要暗室培养外，其余培养条件基本一致。培养温度为（26±2）℃，以日光灯为光源，每天光照时间为12 h（早上8点至晚上8点），光照强度为1 500～2 000 lx。

2 结果与分析

2.1 不同培养基激素组合对种子萌发情况的影响

将消毒好的种子分别播种在1～4号诱导培养基上（表1），观察种子萌发情况。结果表明，冬凤兰种子无菌播种大约3～4个月后陆续有芽点出现，随着培养时间的延长球状凸起不断伸长，形成原球茎或芽（图1-A、图1-B）。从表1可看出，采用不同培养基配方，种子的萌芽时间略有不同。当6-BA浓度为1.0 mg/L时，萌发时间相对0.5 mg/L早，添加CM后萌发时间略有缩短。试验结果表明，6-BA对原球茎芽的诱导起主导作用，而且在添加了CM的培养基上萌发时间会缩短。

2.2 原球茎的增殖培养

冬凤兰的增殖培养采用液体振荡的方式。在100 r/min的转速下振荡培养20 d，切除芽点后的原球茎能快速增殖，增殖率采用称量法进行统计，结果显示增殖率为132.00%。

2.3 不同培养基对冬凤兰原球茎分化培养的影响

将原球茎接种在MS、VW 2种培养基上进行分化培养，芽分化效果略有不同（表2）。在VW培养基上芽分化速度较MS培养基快，且芽分化率高，生长势好；此外，在VW培养基上时，冬凤兰的根也开始分化。

2.4 壮苗生根培养

冬凤兰易生根，在分化培养基中，冬凤兰即有根生成，但是如果添加激素IBA，根长势更好。壮苗生根50 d左右，即可形成健壮的完整植株，生根率达100%。

2.5 组培苗移栽

本研究中先后采用了220 和630或650 mL规格的组培瓶进行试验（图2）。在220 mL的组培瓶中，待冬凤兰成苗后转入生根培养基，转接后1个月左右，苗即顶盖，此时苗还幼嫩，不粗壮，若直接炼苗移栽，成活率低于80%；如果再次转接该规格瓶，因为苗高已顶瓶盖，转接的污染率也较高，此外，当转接不及时、接种苗数多时，会导致根部环绕，如图3所示。如果成苗后转入220 mL组培瓶中，待苗快顶盖时转入630或650 mL的组培瓶中进行壮苗培养，这样冬凤兰组培苗在瓶内可多生长半个多月，此时茎部较粗壮，因此移栽成活率更高，可达95%以上。

待冬凤兰组培苗长至瓶颈口，高约10 cm时，转移至大棚的自然光下炼苗15～30 d后，再开盖炼苗3～5 d；将组培苗取出洗净培养基，用多菌灵浸泡后晾干根部，先用浸泡过的水草包裹根部并移栽入组培盘内。根据前几日的水草湿润度和天气，可暂时不浇水，当水草干透后淋水。待组培苗移栽成活后，可移入含火山石/椰糠+松树皮的混合基质中，保持适当通风和足够湿度，成活率可达到95%左右。

3 讨论

无菌播种是兰科植物种子萌发的主要方法，目前多采用MS培养基对冬凤兰进行无菌播种、组织培养研究。本研究利用常规的升汞消毒蒴果的方法，将冬凤兰种子无菌播种于含6-BA+NAA的诱导培养基上，经暗室培养后萌发出白色原球茎，见光后转绿。其中在 MS+6-BA 1.0 g/L+NAA 0.5 g/L+CM 15%的培养基上时，诱导率较高。罗远华等[2]研究表明，冬凤兰种子在花宝1号或MS培养基上培养90 d后萌芽率达98%以上，可添加适量的CM，低浓度的6-BA和NAA有利于冬凤兰种子形成原球茎，这与本研究结论一致。不过罗远华等[2]采用的外植体处理方式为灼烧法，并认为此法无需杀菌剂且操作简便，是冬凤兰种子理想的灭菌方法。

为了大量增殖原球茎，本研究采用液体振荡的方式。将原球茎接种入VW液体培养基，添加6-BA 1.0 mg/L，并附加白糖30 g/L、活性炭0.4 g/L，pH 5.7。振荡培养20 d后，增殖率为132.00%。

本研究中，将原球茎分别转接入VW和MS 2种分化培養基。在VW培养基中，冬凤兰原球茎分化出芽、根的速度快，分化率高，而且组培苗茎粗，叶片绿。

在研究过程中，一般使用传统的220 mL规格的组培瓶，但是冬凤兰生长速度快，叶细长，如果一直采用此规格的瓶，转接的污染率较高，而且当转接不及时、接种苗数多时，会导致根部环绕。后期炼苗移栽时不能形成单株，如果有一株染病或根部腐烂会导致整瓶十余株感染。因此，冬凤兰在壮苗生根阶段应采用630或650 mL规格的组培瓶，可增加其在瓶内生长时间，提高后期瓶苗移栽成活率。

参考文献

[1] 丁慎言，尹俊梅. 海南岛野生兰花图鉴（第1版）[M]. 北京：中国农业出版社，2015.

[2] 罗远华，冷青云，莫 饶，等. 冬凤兰非共生萌发和低温离体保存[J]. 安徽农业科学，2008，36（9）：8 068-8 069.

[3] 林泋君. 冬凤兰工厂化快速繁殖和移栽技术研究[J]. 北方园艺，2011（12）：116-117.

[4] 叶秀仙，黄敏玲，林榕燕，等. 素心建兰无菌播种快繁技术研究[J]. 福建农业学报，2015，30（10）： 939-943.

[5] 陈 春. 建兰‘岭南奇蝶种子无菌萌发与立体繁殖技术[J]. 亚热带农业研究，2016，12（2）：125-129.endprint