奥迪亚无核与玫瑰香型葡萄杂交胚挽救技术研究

月丫，张娜，田淑芬*，温晓敏

（1. 天津师范大学生命科学学院，天津 300387；2. 天津市设施农业研究所/天津市葡萄遗传与育种企业重点实验室，天津 300192）

奥迪亚无核与玫瑰香型葡萄杂交胚挽救技术研究

月丫1,2，张娜2，田淑芬2*，温晓敏1,2

（1. 天津师范大学生命科学学院，天津 300387；2. 天津市设施农业研究所/天津市葡萄遗传与育种企业重点实验室，天津 300192）

为了培育玫瑰香型、无核、大粒葡萄新品种，以二倍体奥迪亚无核葡萄做母本，以二倍体玫瑰香葡萄和四倍体巨玫瑰葡萄作父本杂交以及奥迪亚无核自交胚珠为材料，进行不同父本、取样时期、发育培养基、萌发培养基、激素对无核葡萄胚挽救效果影响的研究。结果显示：杂交组合奥迪亚无核×玫瑰香的胚发育率和胚萌发率较奥迪亚无核×巨玫瑰的要高；奥迪亚无核×玫瑰香、奥迪亚无核×巨玫瑰的杂交胚珠和奥迪亚无核自交胚珠均在授粉后54 d取种的胚发育率最高；适于杂交组合奥迪亚无核×玫瑰香、奥迪亚无核×巨玫瑰杂交胚发育的培养基为：Nitsch+1.5 mol/L IAA+0.5 mol/L 6-BA+0.5 mol/L GA3+60 g/L蔗糖+5 g/L琼脂+1 g/L活性炭；1/2MS和WPM均可作为奥迪亚无核×玫瑰香的胚萌发培养基；0.1 mg/L 6-BA浓度是奥迪亚无核×巨玫瑰的杂交肧萌发的最佳浓度。

奥迪亚无核葡萄；玫瑰香型葡萄；肧挽救；影响因素

玫瑰香葡萄作为我国栽培面积较大、栽培历史悠久的一个鲜食和酿酒并用的品种，不仅适应性强，而且耐盐碱、丰产[1-2]，是天津滨海地区的优势产品和名牌产品，也是环渤海湾地区的主栽品种。天津农科院葡萄研究中心利用分子生物技术和田间选种相结合的方法从茶淀玫瑰香葡萄中筛选出的玫瑰香优系，较普通玫瑰香品种香气浓郁，果穗松紧度适中，果粒均匀，且优良性状能稳定遗传[3]。本研究以早熟、品质优、丰产性好的二倍体奥迪亚无核葡萄做母本，以香气浓郁的二倍体玫瑰香葡萄优系和四倍体巨玫瑰葡萄作父本杂交以及奥迪亚无核自交胚珠为材料进行胚挽救育种[4-5]。在前人研究基础上进一步筛选、探索杂交组合中不同亲本的取样时间、发育培养基、萌发培养基、激素对无核葡萄胚挽救效果的研究[6-7]。旨在筛选适于以奥迪亚无核葡萄为母本的胚挽救技术，提高无核葡萄胚挽救育种效率。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验于2016年4月～2017年3月在天津市农业科学院葡萄研究中心武清试验基地、天津市葡萄遗传与育种企业重点实验室进行；试材均取自天津市农业科学院葡萄研究中心武清试验基地葡萄园，分别为奥迪亚无核葡萄、玫瑰香葡萄、巨玫瑰葡萄。

杂交组合设计见表1。

1.2 方法

1.2.1 田间杂交

于2016年5月，花穗5%左右的小花开放，开始葡萄花粉的采集工作，放入装有干燥剂（变色硅胶）的瓶中注明品种名称，4 ℃冰箱保存备用。于花前1～3 d进行人工去雄，去雄后第2天进行授粉，每天授粉2次，连授3 d。每次授粉后即刻套袋，标注授粉时间和杂交组合。每种组合杂交15穗。

表1 葡萄杂交组合设计

1.2.2 幼果采集

从6月中旬开始，杂交胚珠的取样时间从最后一次的授粉时期开始计算。授粉之后30 d开始，进行幼果的采集工作，每7 d采取1次杂交幼果，每次300粒，共采摘3次。将采下的幼果带回实验室，剪去果柄，用自来水冲洗数次，之后放入流水中冲洗10 min左右。然后将幼果放置于超净工作台上进行消毒，消毒步骤：用75%酒精冲洗一次，然后用无菌水冲洗幼果3次，接着放入次氯酸钠溶液中浸泡3 min，再用无菌水冲洗幼果3次。

1.2.3 胚发育阶段胚珠培养

将消毒灭菌后的果粒放在灭菌后的培养皿中，无菌条件下用解剖刀切开浆果，注意不要损伤胚珠。取出胚珠之后，将其接种在胚珠发育培养基上进行培养，根据试验设计对其进行不同的处理。每个150 mL三角瓶内接种胚珠15个左右。胚发育培养基分别为：ER/Nitsch+0.5 mg/L GA3+1.5 mg/L IAA+0.5 mg/L 6-BA+60 g/L蔗糖+1 g/L活性炭+5 g/L琼脂两种培养基中。

1.2.4 胚萌发阶段胚培养

在发育培养基中培养60 d后，在无菌情况下将胚珠取出，本试验主要采用剥胚处理方式：在解剖镜下，利用解剖针将杂交胚珠纵切剥开，在胚珠的内喙端取出幼胚，注意不要损伤幼胚，将其接种到不同的幼胚萌发培养基中继续培养促进萌发成苗。胚萌发培养基为添加0.1 mg/L IBA的1/2MS培养基或添加不同浓度6-BA的WPM培养基，其中添加30 g/L蔗糖、5 g/L琼脂，培养基pH5.8。30 d后进行调查。

1.3 数据统计

胚珠培养60 d后统计胚发育率，胚萌发培养30 d后统计胚萌发率。

胚发育率/%=(发育胚数/接种胚珠数)×100

胚萌发率/%=(萌发胚数/接种胚珠数)×100

2 结果与分析

2.1 不同父本对幼胚生长发育的影响

将杂交组合奥迪亚无核×玫瑰香、奥迪亚无核×巨玫瑰的杂交胚珠接种ER培养基上进行培养，研究不同父本对胚发育的影响，如表2所示。

由表2可以看出，不同杂交组合的胚发育率有很大差异，其中杂交组合奥迪亚无核×玫瑰香的胚发育率和胚萌发率相对较高，为58.45%和56.25%，杂交组合奥迪亚无核×巨玫瑰的胚发育率和胚萌发率相对较低，为11.90%和10.63%。由此可见，以奥迪亚无核葡萄作母本时玫瑰香葡萄作为父本更易胚挽救成功。

2.2 不同杂交组合取样时期对幼胚生长发育的影响

将杂交胚珠在授粉47 d后，每隔一周取样一次，共3次取样后进行接种，统计不同取样时期的胚珠发育率与幼胚萌发率，结果如表3所示。由表3可以看出，奥迪亚无核×玫瑰香、奥迪亚无核×巨玫瑰的杂交胚珠和奥迪亚无核自交胚珠均在授粉后54 d取种的胚发育率最高，分别为58.08%、22.81%和22.51%，说明奥迪亚无核为母本与巨玫瑰和玫瑰香杂交的胚珠在授粉后54 d取种进行胚挽救更为有效。

2.3 不同发育培养基对幼胚发育的影响

从表4中可以看出，经过不同的发育培养基Nitsch和ER培养的杂交组合奥迪亚无核×玫瑰香、奥迪亚无核×巨玫瑰的胚发育率均不同。杂交组合奥迪亚无核×玫瑰香在发育培养基Nitsch中的胚发育率为20.45%，而在ER培养基中的胚发育率为10.71%，明显低于在Nitsch培养基中的，所以适宜奥迪亚无核×玫瑰香发育的培养基为Nitsch培养基；杂交组合奥迪亚无核×巨玫瑰在发育培养基Nitsch中的胚发育率为16.66%，在ER培养基中的胚发育率为7.89%，明显低于在Nitsch培养基中的，所以适宜奥迪亚无核×巨玫瑰发育的培养基为Nitsch培养基。这说明Nitsch培养基比ER培养基更适合2种杂交胚珠的发育。

2.4 不同萌发培养基对幼胚萌发的影响

由表5可以看出，奥迪亚无核×巨玫瑰的杂交胚接种在1/2MS和WPM不同的萌发培养基中萌发率都很高，差异不是很大，说明1/2MS和WPM均可作为奥迪亚无核×玫瑰香的萌发培养基。

2.5 不同浓度6-BA对胚萌发的影响

由表6可以看出，奥迪亚无核×巨玫瑰的杂交胚在不同浓度6-BA的WPM培养基中有不同的胚萌发率，当6-BA的浓度为0.1 mg/L时杂交组合奥迪亚无核×玫瑰香的胚萌发率最高，为100.00%。说明0.1 mg/L6-BA浓度是奥迪亚无核×巨玫瑰的杂交胚萌发的最佳浓度。增加6-BA浓度萌发率反而降低，说明高浓度的6-BA可能抑制奥迪亚无核×玫瑰香胚的萌发。

表2 不同亲本基因型下幼胚的生长发育状况

表3 取样时期对离体胚珠培养生长发育的影响

表4 不同培养基对胚珠发育的影响

表5 不同萌发培养基对奥迪亚无核×巨玫瑰胚萌发的影响

表6 不同浓度6-BA对奥迪亚无核×玫瑰香胚萌发的影响

3 讨论与结论

影响胚挽救成功的重要因子之一是接种时期，胚珠接种时间过早或过晚都会影响到胚的发育和成苗[8]；本试验中选取的3个组合分别为：奥迪亚无核×玫瑰香、奥迪亚无核×巨玫瑰、奥迪亚无核自交胚珠均在授粉后54 d取种的胚发育率最高，分别为58.08%、22.81%和22.51%，说明奥迪亚无核为母本与巨玫瑰和玫瑰香杂交的胚珠在授粉后54 d取种进行胚挽救更为有效。无核葡萄胚珠培养成功与否，主要取决于母本基因型，母本品种胚的可挽救性是无核葡萄品种杂交能否成功的最关键因素[9-10]，父本的基因型对胚挽救的成功与否也有非常重要的关系。本试验中的奥迪亚无核×玫瑰香和奥迪亚无核×巨玫瑰的试验结果说明不同杂交组合的胚发育率有很大差异，其中杂交组合奥迪亚无核×玫瑰香的胚发育率和胚萌发率相对较高，为58.45%和56.25%，杂交组合奥迪亚无核×巨玫瑰的胚发育率和胚萌发率相对较低，为11.90%和10.63%。由此可见，以奥迪亚无核葡萄作母本时玫瑰香葡萄作为父本更易胚挽救成功。奥迪亚无核×玫瑰香的杂交是二倍体和二倍体的杂交组合，而奥迪亚无核×巨玫瑰的杂交是二倍体与四倍体的杂交组合，不同倍性葡萄杂交存在较为严重的杂交障碍，因此用二倍体×四倍体葡萄杂交的方法获得后代比较困难[11-12]，这是以奥迪亚无核作母本时巨玫瑰作为父本比较不易胚挽救成功的主要原因。

胚珠离体培养需要培养基供给充足养分，胚发育和胚萌发营养需求不同，需分别探究其适宜的培养基[13-14]。本研究发现，Nitsch培养基比ER培养基更适合奥迪亚无核×玫瑰香和奥迪亚无核×巨玫瑰2种杂交胚珠的发育。本试验采用奥迪亚无核×巨玫瑰的杂交胚接种在1/2MS和WPM不同的萌发培养基中萌发率，发现差异不是很大，说明1/2MS和WPM均可作为奥迪亚无核×玫瑰香的萌发培养基。奥迪亚无核×巨玫瑰的杂交胚在不同浓度6-BA的WPM培养基中有不同的胚萌发率[13]。本研究得出1 mg/L 6-BA浓度是奥迪亚无核×巨玫瑰的杂交胚萌发的最佳浓度，高浓度的6-BA可能抑制奥迪亚无核×玫瑰香胚的萌发。

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Research on embryo rescue techniques of the reciprocal crosses between Otlia Seedless grape and the Muscat grape

YUE Ya1,2, ZHANG Na2, TIAN Shufen2*, WEN Xiaomin1,2
(1. College of Life Science, Tianjin Normal University, Tianjin 300387, China; 2. Tianjin Facility Agriculture Research Institute/Tianjin Enterprise Key Laboratory of Grape Genetics and Breeding, Tianjin 300192, China）

To gain the seedless grape variety with large berry and muscat flavor, the ovules from hybrids of Otilia×Muscat Hamburg, Otilia×Jumeigui and Otilia selfing as experimental materials were cultured in vitro.Factors including the parent's selection, genotypes, sampling dates, development medium types and development temperature were studied. The results were as follows: the cross combination of Otilia×Muscat Hamburg,percentages of embryo development and germination were higher than the combination of Otilia×Jumeigui. The optimal sampling dates was 54 days after bloom. The medium of Nitsch+1.5 mol/L IAA+0.5 mol/L 6-BA+0.5 mol/L GA3+60 g/L sucrose+5 g/L agar+1 g/L activated charcoal was suitable for embryo development of Otilia×Muscat Hamburg and Otilia×Jumeigui. 1/2 MS and WPM could be used as the medium for embryo germination of Otilia×Muscat Hamburg. 0.1 mg/L 6-BA was the optimum concentration for embryo development in Otilia×Jumeigui.

Otlia Seedless; Muscat Hamburg; embryo rescue; infection factor

S663.1；S603.6

A

10.13414/j.cnki.zwpp.2017.06.004

2017-10-23

天津市科技计划项目（16ZXZYNC00160）；天津市农业科学院院长基金（15010）

月丫（1992-），女，在读硕士研究生

*通讯作者：田淑芬（1966-），女，博士，研究员，主要从事葡萄栽培与选育种方面的研究。E-mail: tianshufen@263.net