荷负电气溶胶对大鼠烧伤创面表皮干细胞的影响

佘文莉 王晓东 谢光辉 刘 晖 曹 凤 罗良涛

(暨南大学附属第一医院烧伤整形美容科，广东 广州 510630)

荷负电气溶胶对大鼠烧伤创面表皮干细胞的影响

佘文莉 王晓东1谢光辉 刘 晖 曹 凤 罗良涛2

(暨南大学附属第一医院烧伤整形美容科，广东 广州 510630)

目的分析大鼠烧伤创面采用荷负电气溶胶对表皮干细胞的影响并分析作用机制。方法选取清洁级健康大鼠，在背部侧分别做烧伤创面，随机分为实验组和对照组，实验组采取荷负电气溶胶治疗，对照组大鼠不做任何治疗，分析两组大鼠创面愈合过程，通过免疫组织化学染色法分析干细胞含量，并分析表皮生长因子(EGF)、β1整合素表达变化。结果烧伤24 h后取创面组织染色观察为深Ⅱ度病理改变，第2天基底层细胞增殖，5 d表皮细胞增殖，排列紧密。对照大鼠第3天局部增殖，第7天增殖明显，分布稀疏。经过治疗，相同时间实验组组织切片内阳性单位含量显著大于对照组(Plt;0.05)。实验组平均愈合时间〔(7.1±1.2)d〕显著短于对照组〔(9.5±1.2)d〕。实验组大鼠在伤后EGF和β1整合素该表达；在伤后第3天表达明显增高，第7天仍然维持较高表达，对照组大鼠EGF和β1整合素在伤后第3天有所表达，第7天表达高峰，两组大鼠EGF和β1整合素随着治疗时间不同存在显著差异(Plt;0.05)。结论大鼠烧伤创面实施荷负电气溶胶治疗能够促进表皮干细胞的增殖，其机制可能与EGF、β1整合素表达上升有关。

烧伤创面；表皮干细胞；荷负电气溶胶

烧伤创面愈合受到多种因素的影响，在治疗中关键在于促进皮肤创面的愈合。表皮干细胞是皮肤起源，整合素能够参与调节表皮干细胞增殖分化，因此可以认为促进表皮干细胞分化有可能加快创面的愈合，创面愈合速度和质量可以通过检测表皮干细胞实现〔1〕。负荷电气溶胶能够引起表皮生长因子(EGF)等高表达，促进表皮干细胞组织分化。本文拟分析大鼠烧伤创面采用荷负电气溶胶对表皮干细胞的影响。

1 材料与方法

1.1动物 选取健康清洁级大鼠20只(中山大学北校区实验动物中心提供)，雌雄不限，体重200～250 g，腹腔注射10%水合氯醛麻醉，剂量在0.3 ml/100 g，背部剃毛，作直径2 cm圆性皮肤区。所有大鼠水浴法烧伤，水温设定在85℃，持续时间15 s，组织学检查为深Ⅱ创面。

1.2方法 治疗仪器为珠海科懋生物工程设备有限公司生产生物电创伤治疗仪。大鼠随机分为实验组和对照组各10只，大鼠均按照常规简单清理创面，实验组大鼠采用NB-Ⅰ型生物电创伤治疗仪，调整发射窗距离，自第2日开始每次照射1.5 h，直至创面愈合。对照组大鼠不做气溶胶照射。

1.3观察指标 分别在治疗前、治疗3、7、10 d取组织样本检查。石蜡切片烤片，二甲苯脱蜡，PBS冲洗，清除过氧化物酶，加一抗二抗和三抗，采用PBS清晰标本，DAB液显色，苏木精染色水洗。第一抗体作为对照试验。采用阳性细胞术半定量法，将玻片放在相同光线下观察，棕褐色为阳性，依照阳性细胞数目判断阳性染色程度。采用SABC法测定EGF、β1整合素，在200倍镜下观察免疫组化记录，计算平均阳性单位(PU)值，PU值越小阳性单位越大。

1.4统计学分析 采用SPSS19.0软件行t或者F检验。

2 结 果

2.1免疫组织化学染色结果及创面观察 基底膜上免疫阳性反应细胞较小，呈现椭圆形，内含棕色颗粒，阴性细胞位于基底膜上层和毛囊内层。烧伤24 h后取创面组织染色观察为深Ⅱ度病理改变，第2天基底层细胞增殖，5 d表皮细胞增殖，排列紧密。对照大鼠第3天局部增殖，第7天增殖明显，分布稀疏。治疗组大鼠创面肿胀较对照组轻。平均愈合时间为(7.1±1.2)d，显著短于对照组大鼠愈合时间(9.5±1.2)d(Plt;0.05)。

2.2治疗前后阳性细胞数变化 治疗后，实验组组织切片内阳性单位含量显著大于对照组(Plt;0.05)。见表1。

2.3EGF和β1整合素水平比较 实验组大鼠在伤后第3天EGF和β1整合素表达明显增高，第7天仍然维持较高表达；对照组大鼠在伤后第3天有所表达，第7天表达高峰，两组大鼠EGF和β1整合素随着治疗时间不同存在显著差异(Plt;0.05)。见表2。

表1 创面治疗前后大鼠阳性细胞数变化阳性细胞数/100个细胞)

表2 大鼠EGF和β1整合素免疫组化染色图像分析PU值

3 讨 论

皮肤损伤是影响人类健康的重要威胁之一，皮肤延迟愈合是引起并发症的主要原因之一。目前临床促进创面愈合可以通过两种途径，一种是激活内源性物质，采用EGF、维生素C等激活皮肤干细胞，加速皮肤的愈合；另外一种是外源性应用〔2〕。生物电治疗仪能够产生荷负电气溶胶，可穿透创面、黏膜等组织，直接刺激细胞和坚持，影响细胞生物电的活性，从而产生相应的生物学效应。在以往研究中发现荷负电气溶胶能够显著促进烧伤后创面干细胞的愈合，而且没有出现不良反应。本研究结果表明，采用荷负电气溶胶治疗能够有效促进表皮干细胞的增殖，刺激表皮干细胞，加快创面愈合。

在体外研究中发现正常人10%皮肤基底层有足够增殖潜能的干细胞，其中一半具有增殖分裂能力，分化细胞〔3〕。正常情况下，干细胞数量是恒定的，但是在机械、化学刺激等作用下，停留在G0～G1期的细胞可能出现增殖情况。烧伤后，皮下组织残留的毛细血管等在刺激后，干细胞成为表皮干细胞主要来源，从理论上分析，给予适当刺激有助于细胞增殖。在本组研究中采取荷负电气溶胶，发现表皮干细胞确实存在增殖表现。以往有研究发现外环境变化也会引起表皮细胞逆向分化，针对溃疡创面采用EGF治疗，发现颗粒细胞层聚集成岛状，表皮细胞分化为干细胞，创面表皮呈现多源头性。

大量资料显示参与调节创面愈合过程因素有很多，其中多肽生长因子是最主要的因素之一，能够参与创面细胞增殖、趋化等过程，并能够促进细胞外基质的增生〔4〕。与烧伤创面有关生长因子较多，包括EGF、TGF、IGF等，临床研究发现烧伤创面、慢性溃疡面采用EGF能够显著缩短创面愈合时间。EGF是胶质细胞化学趋化因子，能够有效促进皮肤和黏膜创面组织修复过程，促进皮肤和黏膜创面组织的修复，加速胶质细胞迁移和增殖，并能够诱导α2β1整合素表达。整合素类型较多，能够介导细胞与ECM的黏附，调控细胞增殖，因此是影响伤口收缩重要因子。在以往研究中发现整合素能够与生长因子相互协调参与创面的修复过程〔5〕。有研究指出，整合素能够增强EGF的作用，其中β1整合素是比较具有代表性的因子，高表达时能够促进细胞增殖活化，因此，β1整合素常作为表皮干细胞重要影响因子之一〔6〕。本组研究说明荷负电气溶胶治疗能够参与促进EGF的表达，加快细胞增殖，采用荷负电气溶胶治疗还能够促进创面残留表皮细胞与生长因子结合，诱导干细胞增殖，微环境的变化触发跨膜信号的传导，调节细胞基因表达，产生促修复效应。

大鼠烧伤创面实施荷负电气溶胶治疗能够促进表皮干细胞的增殖，EGF、β1整合素表达上升可能是其作用机制；关于荷负电气溶胶刺激表皮细胞的逆向分化还需要进一步分析。

1李仙松,杜 娟,宋振岚,等.大鼠骨髓间充质干细胞重建表皮细胞及皮肤附件〔J〕.中国组织工程研究,2014；(6):853-9.

2廖锵云,吴晓健,容咏新,等.湿性疗法对创面表皮干细胞影响的研究〔J〕.中国现代医生,2013;51(30):29-30.

3梁 玲,李新平,白文芳,等.低频电磁场在基因修饰表皮干细胞移植修复创面中的作用〔J〕.中国组织工程研究,2013；(32):5827-33.

4王艳波,王思农.表皮干细胞在烧伤创面修复中的作用研究进展〔J〕.社区医学杂志,2014;12(20):58-60.

5吴丽萍,谢肖霞,梁运转,等.荷负电气溶胶对糖尿病慢性创面愈合的效果观察〔J〕.中华损伤与修复杂志(电子版),2010;5(2):224-6.

6王 淞.生物电对表皮干细胞促进创面愈合作用的影响〔D〕.重庆：第三军医大学,2015.

〔2016-05-17修回〕

(编辑 徐 杰)

R644

A

1005-9202(2017)21-5253-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.21.016

国家卫生计生委医药卫生科技发展研究中心“重大疾病防治科技行动计划-创伤修复专项”课题(ZX-01-C2016021)；2014年广州市花都区科技计划项目(HD14CXY001);2014年暨南大学第一临床医学院护理科研专项基金立项项目(2014305)

1 暨南大学附属第一医院神经外科 2 天门市第一人民医院外科

佘文莉(1972-) ，女，主管护师，主要从事烧伤整形外科及慢性创面方面研究。