玉米浆对大肠杆菌JH-B22发酵产L-丙氨酸的影响

刘 枣，付相敏，潘海亮，王金华，王永泽*

(1.湖北工业大学 发酵工程教育部重点实验室，湖北 武汉 430068；2.工业发酵湖北省协同创新中心，湖北 武汉 430068)

玉米浆对大肠杆菌JH-B22发酵产L-丙氨酸的影响

刘 枣1，2，付相敏1，2，潘海亮1，2，王金华1，2，王永泽1，2*

(1.湖北工业大学 发酵工程教育部重点实验室，湖北 武汉 430068；2.工业发酵湖北省协同创新中心，湖北 武汉 430068)

为了进一步降低L-丙氨酸的生产成本，以大肠杆菌JH-B22为发酵菌株，以玉米浆为氮源、葡萄糖结晶废糖液为碳源进行L-丙氨酸的发酵。结果表明，发酵培养基中玉米浆添加量为20 g·L-1较为适宜。在玉米浆发酵培养基中进行L-丙氨酸的发酵，L-丙氨酸产量和糖酸转化率分别为54.30 g·L-1和90.5%；其L-丙氨酸产量略低于无机盐发酵培养基的 56.12 g·L-1和LB发酵培养基的56.48 g·L-1，但玉米浆发酵培养基具有配制更简单、无需额外添加无机盐或者成本较高的酵母粉等优点，可作为L-丙氨酸发酵生产的不错选择。

玉米浆；大肠杆菌；L-丙氨酸

L-丙氨酸在食品和医药领域有着十分重要的应用价值。在食品领域，L-丙氨酸和谷氨酸钠制成混合调味品，在保证食物原有风格的条件下不改变食品的风味，L-丙氨酸还是甜味剂阿力甜的合成前体。在医药领域，L-丙氨酸不但可作为补糖氨基酸直接用作营养液，更是维生素B5、B6和L-氨基丙醇(氧氟沙星)的合成前体，还可用于制造抗癌药4-羟基水杨醛丙氨酸合锌[1-3]。

L-丙氨酸工业生产方法一般采用蛋白水解提取法、酶法和微生物发酵法[4]。微生物发酵法以其生产成本低、产品纯度高、对环境污染小等优点受到了人们的普遍关注。工业上生产L-丙氨酸是借助德阿昆合假单胞菌(Pseudomonasdacunhae)的菌悬液，以 L-天冬氨酸为底物脱羧生产， L-天冬氨酸由富马酸经天冬氨酸酶催化合成，该工艺成本较高且有由二氧化碳排放引起的碳流失[5]。而通过富马酸采用大肠杆菌工程菌直接生产L-丙氨酸，具有成本低的优势[1-2]，但有研究者认为富马酸是经石油炼制生产，反应底物属于不可再生资源[6]。因此如何降低微生物发酵法合成L-丙氨酸的成本且保障原料来源的可再生性是目前相关研究的热点。

借助基因工程的技术和手段，目前已有多个工程菌能直接利用各种易得碳源和氮源合成L-丙氨酸[6-8]。如能换用廉价的氮源或碳源进行L-丙氨酸发酵，无疑对降低L-丙氨酸的生物合成成本有着积极的促进作用。已有报道经基因改造的大肠杆菌可利用甘油作为碳源发酵产L-丙氨酸[6]。

为了进一步降低L-丙氨酸的生产成本，拟从培养基入手降低发酵成本。玉米浆为玉米制淀粉过程中的副产物，含有丰富的可溶性蛋白、无机盐和可溶性糖，可作为微生物发酵的廉价氮源,还能减少培养基中无机盐的添加，从而降低生产成本[9-10]，广泛应用于微生物发酵生产中[11]。前期作者所在课题组利用玉米浆为主的发酵培养基培养大肠杆菌工程菌生产L-乳酸，取得了不错的发酵效果[12]。因此，作者采用大肠杆菌JH-B22作为发酵菌株，以玉米浆为氮源、葡萄糖结晶废糖液为碳源，取代葡萄糖和酵母粉为主的培养基生产L-丙氨酸，考察了发酵效果，拟为降低L-丙氨酸发酵成本提供参考。

1 实验

1.1 菌种与培养基

大肠杆菌JH-B22(ΔfrdBC，ΔadhE，Δpta，ΔldhA ΔpflB::alaD)，出发菌为大肠杆菌EscherichiacoliW (ATCC 9637)，经基因工程手段构建而成，于甘油管-20 ℃保存。

平板培养基(g·L-1)：酵母粉 5，蛋白胨 10，氯化钠 5，葡萄糖 20，琼脂 20。

摇瓶种子培养基(g·L-1)：酵母粉 5，蛋白胨 10，氯化钠 5，葡萄糖 20。

无机盐发酵培养基(g·L-1)：七水硫酸镁 0.5，一水硫酸锰 0.05，磷酸二氢钾 1.5，磷酸氢二钾 3.6，氯化钠5，酵母粉 2，葡萄糖 60。

玉米浆发酵培养基(g·L-1)：玉米浆 20，葡萄糖(来自葡萄糖结晶废糖液)60。

LB发酵培养基(g·L-1)：酵母粉 5，蛋白胨 10，氯化钠 5，葡萄糖 20。

玉米浆(含氮1%)、葡萄糖结晶废糖液，山东潍坊盛泰药业有限公司。其它试剂均为市售分析纯。

E2695型高效液相色谱仪，美国Waters公司；5804R型离心机，德国Eppendorf公司；SBA-40D型生物传感仪，山东科学院生物研究所。

1.2 方法

1.2.1 菌种活化及种子培养

菌种活化：用灭菌后的竹签从甘油管中蘸取菌液，划线至平板培养基中，置于恒温培养箱37 ℃培养24 h。连续活化2～3代。

种子培养：从活化好的平板培养基上挑取少量菌落，接入400 mL摇瓶种子培养基中，摇床37 ℃培养12 h。

1.2.2 玉米浆添加量对发酵产L-丙氨酸的影响

用不同浓度(10 g·L-1、20 g·L-1、30 g·L-1、40 g·L-1)玉米浆和葡萄糖结晶废糖液(葡萄糖浓度60 g·L-1)，配制成培养基后灭菌,即得玉米浆发酵培养基。将摇瓶种子液(OD600为1.0～1.5)按10%接种量接种至装有4 L不同发酵培养基的7 L发酵罐(Sartorius Stedim，Biotech Gmb H 37070)中。发酵条件设定为：温度37 ℃，转速150 r·min-1，通气量1 vvm，流加2 mol·L-1氢氧化钠作为发酵中和剂控制发酵液pH值为6.0。每4 h取样，检测L-丙氨酸产量和葡萄糖含量，每批次发酵重复不少于3次。

1.2.3 玉米浆发酵培养基和其它发酵培养基发酵产L-丙氨酸的比较

将摇瓶种子液按10%接种量分别接种至装有4 L无机盐发酵培养基、玉米浆发酵培养基和LB发酵培养基的7 L发酵罐中，初始葡萄糖浓度均为60 g·L-1。发酵条件同1.2.2。每4 h取样，检测L-丙氨酸产量和葡萄糖含量，每批次发酵重复不少于3次。

1.2.4 检测方法

(1)葡萄糖含量的测定

取适量样品于10 000 r·min-1离心5 min，取上清液稀释100倍，利用生物传感仪测定葡萄糖含量。

(2)L-丙氨酸产量的测定

采用高效液相色谱仪测定。色谱条件：依力特C18色谱柱(4.6 mm×250 mm)，流动相为甲醇-磷酸氢二钠混合液(pH值为6.5的0.05 mol·L-1磷酸氢二钠与甲醇体积比1∶9)，流速0.8 mL·min-1，柱温30 ℃，进样体积5 μL，检测波长215 nm。

(3)甲酸、乙酸、乳酸、琥珀酸产量的检测

采用高效液相色谱仪测定。色谱条件：有机酸柱AminexR HPX-87H ion exclusion column(300 mm×7.8 mm)，流动相为4 mmol·L-1H2SO4，流速0.5 mL·min-1，柱温40 ℃，进样体积5 μL，检测波长210 nm。

2 结果与讨论

2.1 玉米浆添加量对发酵产L-丙氨酸的影响(图1)

图1 玉米浆添加量对发酵产L-丙氨酸的影响Fig.1 Effect of corn steep liquor dosage on L-alanineproduction by fermentation

从微生物培养的角度来看，玉米浆添加量不但影响整个培养基的碳氮比、比耗糖速率[13]，还会调整维生素和金属离子含量来影响发酵[12]。从图1可以看出，添加一定量的玉米浆作为氮源能提高L-丙氨酸的产量，不添加玉米浆时也有少量L-丙氨酸生成(小于3 g·L-1)，可能是由于种子液中残余少量氮源至发酵液中。当玉米浆添加量为20 g·L-1时，L-丙氨酸产量最高，达到54.23 g·L-1。玉米浆添加量超过20 g·L-1时，L-丙氨酸产量提高并不明显。可能是由于，一方面，玉米浆添加过量，许多金属离子浓度过高，影响大肠杆菌的生长及发酵；另一方面，氮源过量容易导致菌体提前衰老自溶，影响产量的提高。综合考虑，玉米浆添加量为20 g·L-1较为适宜。

2.2 玉米浆发酵培养基和其它发酵培养基发酵产L-丙氨酸的比较

为了进一步评估玉米浆发酵培养基的发酵能力，选用2种大肠杆菌发酵常见的无机盐发酵培养基和LB发酵培养基作为对照进行比较，结果见图2及表1。

图2 3种发酵培养基发酵产L-丙氨酸的比较Fig.2 Comparison of L-alanine produced by threefermentation mediums

表13种发酵培养基对发酵产L-丙氨酸的影响

Tab.1Effect of three fermentation mediums on L-alanine production

从图2可以看出，对于3种培养基，0～8 h时L-丙氨酸积累都很少，但8 h后，3种培养基的L-丙氨酸产量出现分化。发酵进行到20 h时，采用LB发酵培养基时，产量已达到最高，残余葡萄糖含量基本趋于零；而采用玉米浆发酵培养基和无机盐发酵培养基时，发酵稍微缓慢，在36 h时发酵才结束。

由表1进一步可知，在LB发酵培养基中L-丙氨酸产量和糖酸转化率分别为56.48 g·L-1和94.1%，且发酵在20 h就基本结束，其它2种发酵培养基发酵36 h后才结束；在玉米浆发酵培养基中L-丙氨酸产量和糖酸转化率分别为54.30 g·L-1和90.5%；在无机盐发酵培养基中L-丙氨酸产量和糖酸转化率分别为56.12 g·L-1和93.5%。所有发酵培养基的副产物如琥珀酸和乙酸产量相差不大，但玉米浆发酵培养基中乳酸产量略高。

方差分析表明，玉米浆发酵培养基在发酵产L-丙氨酸上，与无机盐发酵培养基和LB发酵培养基差异并不显著(Plt;0.05)。玉米浆发酵培养基发酵产L-丙氨酸相对于其它2种发酵培养基，无论是发酵产量和发酵时间均不占优势，与其它2种发酵培养基的组分相比，可能在蛋白的可利用性上存在一些差异。LB发酵培养基中蛋白胨是蛋白经过水解消化的产物；而无机盐发酵培养基中添加的少量酵母粉无疑在L-丙氨酸发酵上扮演了重要角色，不少研究也证明酵母粉作为氮源在产量提高上更有优势[14]。当然玉米浆经过蛋白酶处理，会增加其发酵上的效能[15]，但这样无疑又增加了工序和成本。

玉米浆发酵培养基发酵生产L-丙氨酸仍然具有一定优势：首先，玉米浆作为一种混合氮源，在和糖类一起高压灭菌后，仍有不错的发酵产量。有文献[16]认为滤菌的方式更能保存玉米浆的营养成分，但从生产实践来说，操作难度更大，本实验对玉米浆和碳源采用混合灭菌的方式，工艺相对简单。其次，相对其它2种发酵培养基，没有添加任何额外的无机盐，表明玉米浆发酵培养基中原有的无机盐组分能基本满足发酵的需求。最后，完全不使用酵母粉进行L-丙氨酸的发酵生产，对于降低L-丙氨酸的发酵成本无疑有较大的帮助。

3 结论

为了进一步降低L-丙氨酸的生产成本，以大肠杆菌JH-B22为发酵菌株，从培养基入手降低发酵成本，分别选用玉米生产淀粉副产物玉米浆和葡萄糖结晶废糖液为氮源和碳源，发酵生产L-丙氨酸，并与2种大肠杆菌发酵常见的培养基——LB发酵培养基和无机盐发酵培养基发酵产L-丙氨酸进行对比。结果表明：(1)玉米浆最佳添加量为20 g·L-1，配以葡萄糖结晶废糖液60 g·L-1，能在36 h结束发酵，L-丙氨酸产量可达54.30 g·L-1，糖酸转化率为90.5%。(2)3种培养基中，LB发酵培养基发酵产L-丙氨酸效果最好，L-丙氨酸产量和糖酸转化率分别为56.48 g·L-1和94.1%，且发酵在20 h基本结束。无机盐发酵培养基发酵产L-丙氨酸产量和糖酸转化率分别为56.12 g·L-1和93.5%，发酵在36 h基本结束。(3)相比无机盐发酵培养基和LB发酵培养基，玉米浆发酵培养基产L-丙氨酸产量只有微小差别，但仍然能在36 h内完成发酵，且玉米浆培养基可直接和碳源一起灭菌，无需添加任何酵母粉和额外的无机盐，在成本上也具有一定优势。因此玉米浆发酵培养基可作为L-丙氨酸发酵的不错选择。

[1] 王贝贝，曹恒霞，张建嵩，等.膜技术在 L-丙氨酸提纯工艺中的应用研究[J].中国酿造，2015，34(9):101-103.

[2] 徐友强，马玉岳，姚粟，等.重组大肠杆菌转化富马酸生产 L-丙氨酸[J].生物加工过程，2016，14(2):7-11.

[3] 毛建卫.DL-α-丙氨酸的制备工艺及在食品工业中的应用[J].食品工业科技，2000(6):7-8.

[4] KENGEN S W，STAMS A J.Formation of L-alanine as a reduced end product in carbohydrate fermentation by the hyperthermophilic archaeonPyrococcusfuriosus[J].Archives of Microbiology，1994，161(2):168-175.

[5] 徐虹，王雪根.利用假单胞菌天冬氨酸-β-脱羧酶高效生产 L-丙氨酸[J].南京化工学院学报，1995，17(1):1-6.

[6] 周丽，邓璨，崔文璟，等.利用重组大肠杆菌发酵甘油合成 L-丙氨酸[J].现代食品科技，2016(6):163-169.

[7] HOLS P，KLEEREBEZEM M，SCHANCK A N，et al.Conversion ofLactococcuslactisfrom homolactic to homoalanine fermentation through metabolic engineering[J].Nature Biotechnology,1999,17(6):588-592.

[8] ZHOU L，DENG C，CUI W J，et al.Efficient L-alanine production by a thermo-regulated switch inEscherichiacoli[J].Applied Biochemistry Biotechnology,2016,178(2):324-337.

[9] 华渤文，赵锦芳，王金华，等.重组大肠杆菌利用不同培养基发酵产琥珀酸的研究[J].食品工业科技,2013，34(6):227-230.

[10] 徐凯，赵筱，王金华，等.红酵母科用玉米浆发酵产富含类胡萝卜素功能饲料的研究[J].饲料工业，2013(1):34-37.

[11] 向梦雄，闫兴，王常高，等.玉米浆中金属离子对三孢布拉霉发酵生产β-胡萝卜素的影响[J].中国酿造，2014，33(11):70-74.

[12] WANG Y，LI K,HUANG F，et al.Engineering and adaptive evolution ofEscherichiacoliW for L-lactic acid fermentation from molasses and corn steep liquor without additional nutrients[J].Bioresource Technology，2013，148:394-400.

[13] 唐军，黄良军，蔡水洪，等.玉米浆用量，渗透压和耗糖速率对甘油发酵的影响[J].华东理工大学学报(自然科学版)，2001，27(3):234-237.

[14] 张乐，刘龙，李江华，等.玉米浆对丁二酸发酵的影响[J].食品与生物技术学报，2014，33(3):301-307.

[15] 李黔蜀，叶华，贺立虎.玉米浆作为氮源对透明质酸发酵的影响[J].杨凌职业技术学院学报，2011，10(2):5-7.

[16] 牛建双，吕淑霞，赵朔，等.玉米浆对 Vc 二步发酵产 2-酮基-L-古龙酸影响的研究[J].微生物学杂志，2011，31(2):29-31.

EffectofCornSteepLiquoronL-AlanineFermentationbyEscherichiacoliJH-B22

LIU Zao1，2，FU Xiang-min1，2,PAN Hai-liang1，2，WANG Jin-hua1，2，WANG Yong-ze1，2*

(1.KeyLaboratoryofFermentationEngineeringofMinistryofEducation，HubeiUniversityofTechnology，Wuhan430068，China;2.HubeiCooperativeInnovationCenterforIndustrialFermentation，Wuhan430068，China)

In order to reduce the production cost of L-alanine,we usedEscherichiacoliJH-B22 as a fermentation strain,corn steep liquor as a nitrogen resource,and waste sugar liquid of glucose crystallization as a carbon resource to produce L-alanine by fermentation.Results showed that it was suitable to add 20 g·L-1corn steep liquor in fermentation medium.When using corn steep liquor fermentation medium，L-alanine yield and sugar-acid conversion rate would reach 54.30 g·L-1and 90.5%，respectively.Although L-alanine yield of corn steep liquor fermentation medium was less than that of mineral salts fermentation medium(56.12 g·L-1) and LB fermentation medium(56.48 g·L-1),corn steep liquor fermentation medium could be a good choice for L-alanine production because of easy preparation and unnecessary additional mineral salts or high cost yeast powder.

corn steep liquor；Escherichiacoli；L-alanine

湖北省自然科学基金项目(2011CDB076),湖北省教育厅科研基金项目(B20121402)

2017-06-27

刘枣(1980-)，女，湖北武汉人，实验师，研究方向：发酵及检测技术，E-mail：24825848@qq.com；通讯作者：王永泽，博士，副教授，E-mail:wyzzju@126.com。

10.3969/j.issn.1672-5425.2017.11.003

刘枣，付相敏，潘海亮，等.玉米浆对大肠杆菌JH-B22发酵产L-丙氨酸的影响[J].化学与生物工程，2017，34(11)：11-14.

TQ922.2 Q815

A

1672-5425(2017)11-0011-04