涪陵胭脂萝卜多倍体诱导研究

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(长江师范学院生命科学与技术学院， 重庆 涪陵 408100)

涪陵胭脂萝卜多倍体诱导研究

吴照云，陈发波，姚启伦，方平，刘毅

(长江师范学院生命科学与技术学院， 重庆 涪陵 408100)

以不同浓度秋水仙素溶液处理胭脂萝卜幼苗茎尖生长点，通过苗期和成株期对诱变植株和正常二倍体植株进行形态学和细胞学鉴定,探讨四倍体胭脂萝卜的诱导方法与途径。结果表明，5种浓度秋水仙素都能诱变出四倍体胭脂萝卜，其中2 g/L秋水仙素诱变率最大，为33.3%。四倍体胭脂萝卜平均叶片厚度、叶长、株高、叶宽和开展度较二倍体分别增加32.4%、39.6%、39.8%、24%和31.7%,四倍体胭脂萝卜叶片单位视野内的气孔数目少于二倍体72.2%，但气孔的横径和纵径分别较二倍体大40.8%和30.7%。说明叶片厚度、叶长、株高、叶宽、开展度、气孔数目、气孔的横径和纵径等性状可以作为四倍体鉴定的重要特征，特别是气孔数目、气孔的横径和纵径可以作为快速鉴定四倍体与二倍体胭脂萝卜的重要指标。利用秋水仙素诱导是获得四倍体胭脂萝卜的有效途径之一。

胭脂萝卜； 同源多倍体； 秋水仙素； 诱导

胭脂萝卜是十字花科(Brassicaceae)萝卜属(Raphanus)萝卜种(RaphanussativusL.)下的一个栽培品种，主产重庆市涪陵区及周边地区，是继榨菜之后的第2个涪陵特产[1]。胭脂萝卜含有大量天然色素——萝卜红，是提取天然色素的理想原料[2-4]。随着人们生活水平的提高，对天然色素的需求越来越大。但目前所种植的胭脂萝卜色素含量不高、产量低，种质资源混杂、退化现象严重[5-7]，急需拓展胭脂萝卜种质资源。近年来，利用化学试剂诱导多倍体，是创制新的萝卜种质资源的有效途径之一，已成功的运用于萝卜新品种的选育。戴忠良等[8]、张红亮等[9-10]、Thanh等[11]、张蜀宁[12]和吕炜等[13]利用秋水仙素或氟乐灵处理萝卜幼苗，均获得了四倍体萝卜，他们的研究均表明，四倍体萝卜在根重、株高、叶片厚度、种子单粒径、花粉粒大小、花器官大小和气孔大小等方面均表现“巨大型”。但关于胭脂萝卜四倍体诱导方面的研究报道相对较少。本研究利用不同浓度秋水仙素处理胭脂萝卜幼苗，筛选适合于胭脂萝卜多倍体诱导的秋水仙素浓度，探明四倍体胭脂萝卜与二倍体植株在形态结构和叶片气孔等性状上的差异，以期创制新的胭脂萝卜种质资源，为高产、优质胭脂萝卜品种的选育提供基础材料。

1 材料与方法

1.1 材 料

供试材料为“红心1号”胭脂萝卜，由重庆市渝东南农业科学院提供。

1.2 方 法

1.2.1 试验设计

利用盆栽法，采用随机区组设计，3次重复，每个浓度秋水仙素处理10盆胭脂萝卜，每盆种植3株胭脂萝卜。

1.2.2 四倍体的诱导

播种后，待幼苗长至2叶1心时，分别用1，1.5，2，2.5 g/L和3 g/L的秋水仙素溶液处理幼苗生长点，各浓度分别处理30盆，5盆胭脂萝卜用蒸馏水处理作为对照。每天07：00-08:00时、18：00-19:00时各处理1次，连续处理5 d。

1.2.3 四倍体的鉴定

在胭脂萝卜抽薹前，以蒸馏水处理的胭脂萝卜为对照，对胭脂萝卜叶片的皱缩程度、叶片厚度、叶长、株高、叶宽、开展度、气孔密度、气孔大小等性状进行观察鉴定。气孔鉴定的方法是分别取下植株中无病虫害的叶片，迅速放入冰中10～15 min，然后将部分叶片撕下放入FAA固定液(福尔马林(38%甲醛)5 mL，冰醋酸5 mL，70%酒精90 mL)固定15 min，之后撕取下表皮，制作成临时装片，用尼康80 i研究级正置显微镜观察、拍照、测量气孔的横径和纵径，记录每张装片5个视野内的气孔数，取10株获取数据资料，最后取平均值作为该植株的气孔数。

2 结果分析

2.1 不同浓度秋水仙素的诱导率

由表1可以看出，不同浓度秋水仙素都可以诱导出四倍体胭脂萝卜，共种植450株胭脂萝卜，鉴定出变异株91株，诱导率为20.2%。对不同处理间的诱导率进行方差分析，结果见表2。从表2可知，不同浓度秋水仙素处理间诱导率存在极显著差异，其中2 g/L秋水仙素诱导的变异率最高。从图1可以看出，随着秋水仙素浓度的增高，诱变的四倍体植株增多，当秋水仙素浓度增加到一定浓度后，诱变的四倍体植株减少。

表1 不同浓度秋水仙素的诱导率

项目秋水仙素浓度(g/L)11．522．53 处理植株数(株)9090909090 变异数(株)1016302213 诱变率(%)11．117．833．324．414．4

表2 不同浓度秋水仙素诱导率方差分析

变异来源平方和自由度均方F值 区组间25．76212．8852．36∗∗ 处理间474．894118．72482．68∗∗ 误差1．9780．25 总变异502．6214

注：“**”表示在0.01显著水平。

图1 不同浓度秋水仙素诱导率

2.2 四倍体胭脂萝卜的主要形态特征

分别在苗期(图2)和成株期(图3)将诱变植株与二倍体植株进行比较，发现诱变植株的叶片较卷曲，叶片的皱缩程度较大，根茎增粗，在叶长、叶宽、株高、植株开展度等性状上与二倍体植株也有较大差异。从图4可以看出，在成株期，相对于二倍体胭脂萝卜植株，四倍体植株的叶厚度、叶长、株高、叶宽、开展度均高于二倍体，t检验结果(表3)表明，四倍体植株的叶厚、叶长、株高、叶宽和开展度均显著高于二倍体。四倍体植株的平均叶片厚度、叶长、株高、叶宽、开展度较二倍体植株分别增加32.4%、 39.6%、39.8%、24%和31.7%。叶片厚度、叶长、株高、叶宽和开展度等性状可以作为四倍体鉴定的重要特征。

图5 四倍体植株(a)和二倍体植株(b)气孔

图2 苗期四倍体(a)与二倍体(b)胭脂萝卜

图3 成株期四倍体(a)和二倍体(b)胭脂萝卜

表3 二倍体植株和四倍体植株性状差异显著性分析

性状叶厚(cm)叶长(cm)株高(cm)叶宽(cm)植物开展度二倍体0．2521．2225．36．2435．5四倍体0．3735．15428．2252df1818181818t0．051．7341．7341．7341．7341．734︱t︱7．5∗105．37∗55．67∗29．55∗19．41∗

注：*表示在0.05水平上显著。下同。

图4 二倍体植株和四倍体植株的性状比较

2.3 四倍体胭脂萝卜的气孔特征

从图5和图6可以看出，二倍体胭脂萝卜叶片单位视野内的气孔数明显多于四倍体植株，但是四倍体植株气孔的横径和纵径都大于二倍体植株。四倍体植株单位视野内的气孔数目少于二倍体植株72.2%，但气孔的横径和纵径分别较二倍体植株大40.8%和30.7%。t检验结果(表4)表明，二倍体胭脂萝卜单位视野内的气孔数显著多于四倍体植株，但是四倍体植株气孔的横径和纵径都显著大于二倍体植株。

表4 二倍体植株和四倍体植株气孔数目、气孔横径、纵径差异显著性分析

气孔数目(个/视野)气孔横径(×10-3cm)气孔纵径(×10-3cm) 二倍体181．522．25 四倍体52．573．25 df181818 t0．051．7341．7341．734 ︱t︱12．26∗26．25∗57．8∗

3 讨 论

3.1 关于利用秋水仙素诱导四倍体胭脂萝卜的探讨

秋水仙素是诱导多倍体的有效试剂，目前已有较多科学家利用秋水仙素将二倍体植物成功诱导为四倍体。汪剑鸣研究表明，秋水仙素浓度越高, 白萝卜的变异率越高[14]。张红亮等采用不同质量浓度的秋水仙素处理子叶期萝卜茎尖生长点，结果表明，经2 g/L秋水仙素处理6次获得同源四倍体的效果最佳, 四倍体诱导率达到4.5%[9]。在本实验中，随着秋水仙素浓度(1～3 g/L)的增高，诱变的四倍体植株增多，当秋水仙素浓度增加到一定浓度后，诱变的四倍体植株减少，主要原因是高浓度秋水仙素处理后的幼苗，植株生长严重受到抑制，容易死亡。用2 g/L秋水仙素诱导四倍体胭脂萝卜的效果最好，诱导率达33.3%，这与汪剑鸣[14]和张红亮等[9]的研究结果一致，认为经2 g/L秋水仙素处理获得同源四倍体的诱导率最高。戴忠良等的研究结果表明，以0.2 g /L秋水仙素连续处理3 d的效果最好[8]，但0.2 g/L秋水仙素诱导率仅16%，低于本实验中胭脂萝卜四倍体的诱导率。这可能与诱导的品种不同、处理的时间不同有关，也可能与四倍体鉴定的方法不同有关。

图6 二倍体植株和四倍体植株气孔数目、气孔横径、纵径的比较

3.2 四倍体胭脂萝卜主要特征

已有研究均表明，四倍体萝卜与二倍体萝卜相比较，存在较大差异[8-14]，如四倍体萝卜在保卫细胞中叶绿体数目、萝卜花粉粒大小、花器官大小、叶片厚度、种子单粒径、根重、株高、十叶厚、抗性、净光合速率、气孔导度、细胞间所吸收的二氧化碳浓度和蒸腾速率等方面均显著大于二倍体萝卜，其所含的营养物质，如维生素C、可溶性糖和还原糖等也较二倍体多，四倍体萝卜的气孔大于二倍体，气孔密度明显小于二倍体萝卜，但多倍体的育性降低[8-14]。本实验结果表明，四倍体胭脂萝卜的平均叶片厚度、叶长、株高、叶宽和开展度较二倍体植株分别增加32.4%、 39.6%、39.8%、24%和31.7%，四倍体胭脂萝卜叶片单位视野内的气孔数目少于二倍体植株72.2%，但气孔的横径和纵径分别比二倍体植株大40.8%和30.7%。说明叶片厚度、叶长、株高、叶宽、开展度、气孔数目、气孔的横径和纵径等性状可以作为四倍体鉴定的重要特征，特别是气孔数目、气孔的横径和纵径可以作为快速鉴定四倍体与二倍体胭脂萝卜的重要指标。

由于材料和时间有限，本研究没有分析四倍体胭脂萝卜的红色素含量、品质性状、染色体数目和育性等，但获得了四倍体胭脂萝卜的种子，下一步实验需要进一步鉴定诱导突变体的特征。

[1]陈发波,李春明,姚启伦,等.不同施肥处理对胭脂萝卜主要性状的影响[J].安徽农业大学学报,2016,43(3):441-446.

[2]阳晖,赵学勤,李昌满,等.胭脂萝卜废渣中提取萝卜硫素的酶解工艺优化[J].食品工业科技,2016,37(5):207-211.

[3]董楠,王强,雷丹丹,等.胭脂萝卜红色素热处理及贮藏过程中降解动力学[J].食品科学,2013,34(5):67-71.

[4]时建伟,腾晓旭,曹团武.涪陵胭脂萝卜红色素的提取、分离及精制研究进展[J].广州化工,2016,44(2):6-8.

[5]陈发波,方平,姚启伦,等.涪陵红心萝卜起源进化的分子系统学[J].贵州农业科学,2014,42(11):7-11.

[6]吕发生,陶洪英,谭革新,等.杂交红心萝卜胭脂红1号高产制种模式研究[J].种子,2015,34(1):110-113.

[7]秦家顺,许明惠,李昌满.胭脂萝卜主要农艺性状对肉质根产量的影响[J].河南农业科学,2014,43(1):107-109.

[8]戴忠良,张振超,秦文斌,等.四倍体红心萝卜的诱导及其特征分析[J].江苏农业学报,2012,28(6):1 505-1 507.

[9]张红亮,张蜀宁,张伟.秋水仙素诱导同源四倍体萝卜的研究[J].南京农业大学学报,2008,31(3):47-50.

[10]张红亮,韩业飞,柳季旺,等.二倍体和同源四倍体萝卜光合特性研究[J].天津农业科学,2012,18(4):1-4.

[11]Thanh L C,姜二花,王康,等.利用氟乐灵进行同源四倍体萝卜种质创制研究[J].基因组与应用生物学,2012,31(3):276-281.

[12]张蜀宁,张伟,张红梅.同源四倍体萝卜花粉母细胞减数分裂[J].南京农业大学学报,2009,32(1):27-30.

[13]吕炜,户秋稳,李艳艳,等.优质四倍体萝卜新种质创新及鉴定[J].南京农业大学学报,2016,39(1):48-54.

[14]汪剑鸣.秋水仙素诱导白萝卜研究初报[J].安徽农业科学,2008,36(3):985-987.

Study on Polyploid Induction of Red Radish Using Colchicinein Fuling District

WUZhaoyun,CHENFabo,YAOQilun,FANGPing,LIUYi

(Department of Life Sciences,Yangtze Normal University,Fuling Chongqing 408100,China)

Red radish with rich red radish pigment is an important commercial root vegetable,which is barely cultivated in Fuling district Chongqing city with low production and deficiency germplasm resources.It is very necessity to create new red radish germplasm resources.In this study,red radish was used to induct polyploid with 1 g/L,1.5 g/L,2 g/L,2.5 g/L,and 3 g/L colchicine on heart leaves in the seedlings time.The autotetraploid red radish was created by identifying the characteristics of morphology and cytology between polyploid and normal red radish.The results showed that autotetraploid red radish can be created using different concentrations of colchicine solution,while the autotetraploid red radish was well created with the induction rate as high as to 33.3% using 2 g/L colchicine.The leaf thickness,leaf length,plant height,leaf width,and plant expansion of autotetraploid red were 32.4%,39.6%,39.8%,24%,and 31.7% higher than diploid red radish,respectively.And the stomatal number of leaf per unit in autotetraploid was 72.2% less than the diploid,while the the hole diameter and the longitudinal diameter were 40.8% and 30.7% greater than the diploid,respectively.The results showed that leaf thickness,leaf length,plant height,leaf width,plant expansion,stomatal number of leaf,and the hole diameter and the longitudinal diamete of stomatal are importat traits that can be used in the identification of autotetraploid in red radish,especelly stomatal number of leaf,and the hole diameter and the longitudinal diamete of stomatal.It indicat that it is one of the effective ways to induce autotetraploid using colchicine in red radish.

red radish; autotetraploid; colchicine; induction

2016-11-17

重庆市科委基础与前沿一般项目(cstc 2016 jcyjA 0136)。

吴照云(1994—)，男，重庆秀山人；学士，主要从事作物遗传育种研究。

通迅作者：陈发波，副教授；E-mail:chenfabo963@126.com。

10.16590/j.cnki.1001-4705.2017.03.038

S 637

A

1001-4705(2017)03-0038-04