过表达THEM4对高糖诱导的人肾小管上皮细胞胶原分泌的影响

陈 宁，郝 军，朱桂云，安晓颖，康丽菲，李晓霞，杨永辉

(1. 河北省胸科医院病理科，河北 石家庄 050041；2. 河北医科大学病理学教研室，河北 石家庄 050017)

目前普遍认为肾小管间质纤维化是糖尿病肾病发展为终末期肾功能衰竭(end-stage renal disease, ESRD)的病理基础，而肾小管上皮细胞向间质细胞转分化(epithelial to mesenchymal transition, EMT)以及导致的细胞外基质(extracellular matrix, ECM)的过度积聚是肾小管间质纤维化发生的前提[1]。新近研究揭示PI3K/Akt信号通路的异常激活与糖尿病肾病ECM沉积相关[2]。而硫酯酶超家族成员4(thioesterase superfamily member 4, THEM4)作为Akt的内源性负向调控因子[3]是否参与了糖尿病肾病ECM沉积的发生，目前尚未见报道。因此，本研究通过构建THEM4过表达质粒并转染至人肾小管上皮细胞(human renal proximal tubular epithelial cell, HKC)内，观察高糖刺激下PI3K/Akt/THEM4的表达与胶原分泌的关系(胶原是ECM的主要组成成分)，以及过表达THEM4能否起到干预作用，为糖尿病肾病ECM沉积的防治提供新的思路。

1 材料

1.1细胞株人肾小管上皮细胞株HKC来自河北医科大学病理学实验室冻存。

1.2试剂pYr-ads-4-THEM4 vector、pYr-adshuttle-4 empty vector均购自长沙赢润生物有限公司；人Collagen Ⅰ ELISA试剂盒、人Collagen Ⅲ ELISA试剂盒均购自BlueGene Biotech；TRITC-羊抗兔IgG、兔抗THEM4单克隆抗体(14692-1-AP)、兔抗β-actin单克隆抗体(20536-1-AP)、兔抗α-SMA单克隆抗体(14295-1-AP)，均购自美国Protein Tech公司；兔抗phospho-Akt (Ser 473)单克隆抗体(#4060)、兔抗Akt单克隆抗体，均购自美国Cell Signaling公司；兔抗TGF-β1单克隆抗体(#AP12348a) 购自ABGENT。

1.3仪器荧光显微镜、相差倒置显微镜(日本Olympus公司)；CO2培养箱(日本SANYO)；高速低温离心机(德国Eppendorf公司)。

2 方法

2.1HKC细胞实验分组用含10%胎牛血清的DMEM培养基常规培养人肾小管上皮细胞，采用Lipofectamine 2000分别转染pYr-ads-4-THEM4表达质粒及pYr-adshuttle-4空质粒，转染后的细胞进行G418(800 mg·L-1)抗性筛选，将筛选出的阳性克隆细胞进行传代培养。……