实时荧光定量PCR方法检测转基因玉米MIR604

常丽娟，宋 君，张富丽，刘文娟，唐春燕，王 东，尹 全

(四川省农业科学院分析测试中心，四川 成都 610066)

实时荧光定量PCR方法检测转基因玉米MIR604

常丽娟，宋 君*，张富丽，刘文娟，唐春燕，王 东，尹 全

(四川省农业科学院分析测试中心，四川 成都 610066)

转基因玉米MIR604是瑞士先正达公司2005年研发的抗虫玉米，中国于2008年批准MIR604进口作为食品和饲料的加工原料。为了精确定量检测MIR604及其加工产品，在MIR604的左侧边界序列和玉米基因组之间设计引物和探针，成功建立了MIR604品系特异实时荧光定量PCR检测方法。采用该方法设计的引物和探针，对6种非转基因作物、MIR604及其他非目标转基因作物进行检测，除MIR604外，其余样品均未检测到MIR604分子片段的扩增信号；对已知含量为1%的MIR604标准品进行定量检测，测量值为1.07%，接近真实值1%；灵敏度实验结果显示，该方法能检测到仅5个拷贝的MIR604分子片段。该试验所建立的MIR604品系特异实时荧光定量PCR检测方法具有较高的特异性、准确度及灵敏度，可用于转基因玉米MIR604的定量检测。

转基因玉米MIR604；实时荧光定量PCR；特异性；准确度；灵敏度

转基因作物在全球快速发展，据国际农业生物技术应用服务组织(ISAAA)发布的一份报告，转基因作物的种植面积从1996年的170万hm2上升至2015年的1.797亿hm2，种植的转基因品种包括转基因大豆、玉米、棉花和油菜，其中玉米是获得商业种植批准最多的转基因作物。James等[1]调查发现，全球有超过120个转基因玉米品种在二十多个国家被批准可作为食品和饲料的加工原料。转基因玉米MIR604是转入苏云金芽孢杆菌Cry3A基因的抗虫玉米，由该基因编码的毒素蛋白由3个不连续的结构域组成，对鞘翅目昆虫具有特异毒性[2]。自2007年起，MIR604先后在美国、菲律宾、俄罗斯、韩国和日本等多个国家被批准可进口作为食品和饲料的加工原料。我国于2008年批准MIR604进口作为食品和饲料的加工原料。MIR604进入中国市场后，按照我国转基因标识管理办法规定，MIR604及其加工产品必须进行标识。目前，我国转基因生物安全检测体系中只有MIR604及其加工产品的定性检测标准[3]，尚无相关的定量检测标准。国际上欧盟曾经发布过基于TaqMan探针的实时荧光定量PCR检测标准[4]，但国内尚未对该标准进行确证。为了精确定量MIR604，本试验建立了MIR604品系特异实时荧光定量PCR检测方法，为我国转基因玉米安全监管提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料

实验所用的含量为1%和10%的MIR604标准物质(Certified Reference Material，CRM)及其他转基因作物粉末材料均购自欧盟联合研究中心测量与标准物质研究所(IRRM，Institute for Reference Materials and Measurements，Joint Research Centre (JRC)，Belgium)；实验所用的非转基因作物材料由本实验室保存。

1.1.2 试剂与仪器

实验所用的植物基因组DNA纯化试剂和实时聚合酶链式反应试剂(Real Time Polymerase Chain Reaction (PCR) Master Mix)，购自TIANGEN®天根生化科技(北京)有限公司。实验所用的主要仪器有超微量分光光度计(Nanodrop®1000， Thermo Fisher Scientific Corporation)和实时荧光PCR系统(Real Time PCR System 7500， Applied Biosystem Corporation， USA)。

1.2 方法

1.2.1 DNA的分离与纯化

按照植物基因组DNA纯化试剂盒(TIANGEN®，天根生化科技(北京)有限公司)说明书分离、纯化基因组DNA。

1.2.2 引物和探针设计

玉米内标基因zSSⅡb采用国家标准GB19495.4—2004中的引物和探针序列[5]，通过查询MIR604的载体和旁侧序列信息(http://www.shgmo.org/welcome.htm)，应用 Primer Express 3.0 在左侧边界序列和玉米基因组连接处设计定量 PCR引物和探针，所有引物与探针均由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2.3 反应体系及条件

将DNA稀释到50 ng·μL-1，取4 μL DNA加入到20 μL反应体系：TaqMan Master mix(2×)10 μL，上下游引物(10 μmol·L-1)各1 μL，探针(10 μmol·L-1)0.5 μL，补水至20 μL。运行如下程序：95 ℃预变性10 min，1个循环；95 ℃变性15 s，60 ℃退火60 s，45个循环。

1.2.4 方法的特异性、准确度和灵敏度

采用本方法对非转基因玉米、水稻、大豆、棉花、油菜、甜菜以及15个转基因玉米59122、DAS-40278-9、3272、Mon863、Mon810、Mon88017、Bt11、Bt176、NK603、TC1507、T25、GA21、MIR162、MIR604、98140，5个转基因水稻TT51-1、科丰2号、科丰6号、克螟稻5、M12，5个转基因大豆GTS40-3-2、Mon87701、Mon87708、A5547-127、A2704-12，5个转基因棉花Mon1445、Mon15985、Mon531、LLcotton25、GHB614，6个转基因油菜GT73、MS1、MS8、RF1、RF2、RF3和1个转基因甜菜H7-1进行了特异性检测，确定本方法的特异性。

分别提取1%和10%的转基因玉米MIR604基因组DNA，将10% MIR604基因组DNA按照1∶5梯度稀释成42.00、8.40、1.68、0.34、0.07 ng 5个梯度作为标准曲线，以1%MIR604基因组DNA为检测样品进行定量检测，检测样品重复10次扩增反应，计算1%MIR604标准物质的测量值。

将转基因玉米MIR604的基因组DNA按照1∶2梯度稀释成0.184、0.092、0.046、0.023、0.012 ng 5个梯度，每个梯度重复8次扩增反应。根据玉米基因组大小，计算出每个梯度反应体系中MIR604分子片段的拷贝数(copies)。

1.3 数据处理

采用 Excel 2007和SPSS 13.0 软件进行数据处理和统计分析。

2 结果与分析

2.1 引物和探针设计

转基因玉米MIR604的T-DNA插入序列(图1)含有2个外源基因表达盒(gene expression cassette)，一个是包含MTL启动子、Cry3A编码基因和tNOS终止子的基因表达盒，另一个是包含ZmUbiInt 启动子、pmi编码基因和tNOS终止子的基因表达盒。应用 Primer Express 3.0 在左侧边界序列和玉米基因组连接处设计定量 PCR引物和探针(表1)，扩增产物长度为124 bp。

箭头代表引物与探针的设计位置和方向The arrows show the location and orientation of primers and probes图1 MIR604 外源载体结构示意图(A)和MIR6043′端旁侧序列(B)Fig.1 Schematic diagrams of the inserted T-DNA region of gene construct for genetically modified maize MIR604 (A) and the sequences flanking the 3′ of the T-DNA in genetically modified maize MIR604 (B)

表1转基因玉米MIR604定量检测的引物和探针

Table1The primers and probes used for the quantitative detection of genetically modified maize MIR604

基因名称Genename引物和探针序列Sequenceofprimersandprobes扩增产物长度Lengthofamplificationproducts/bp内源基因zSSⅡbEndogenousgenezSSⅡbzSSⅡb-F:5'-CTCCCAATCCTTTGACATCTGC-3'zSSⅡb-R:5'-TCGATTTCTCTCTTGGTGACAGG-3'zSSⅡb-P:5'-FAM-AGCAAAGTCAGAGCGCTGCAATGCA-TAM-RA-3'151MIR604分子片段MolecularfragmentofMIR604Eve-F:5’-GCCGTATCCGCAATGTGTTAT-3’Eve-R:5’-CGACGCTTGCGCGAG-3’Eve-P:5’-FAM-AGAGTTGGTGGTACGGGTA-TAMARA-3’124

2.2 方法的特异性

采用本方法设计的引物和探针对6种非转基因作物、MIR604及其他非目标转基因作物进行检测，只有MIR604检测到扩增信号(图2)，其他非转基因作物和非目标转基因作物均未检测到扩增信号，显示本试验建立的检测方法具有很高的特异性。

2.3 方法的准确度

将10%的MIR604标准物质DNA等比稀释建立标准曲线，玉米内源基因zSSⅡb的标准曲线方程为Y=-3.45X+31.97，相关系数R2为0.998，扩增效率为95.00%；MIR604分子片段的标准曲线方程为Y=-3.31X+33.76(图3)，相关系数R2为0.996，扩增效率为100.10%。采用本方法对已知浓度为1%的MIR604标准物质进行定量检测，测试样品平均相对含量为1.07%(表2)，测量值与真实值的相对偏差为7%，说明该方法具有较高的准确度[6]。

S型曲线为转基因玉米MIR604的扩增曲线；水平直线为非转基因作物及其他非目标转基因作物的扩增曲线The S-liked curve presented the amplification of genetically modified maize MIR604 and the horizontal straight line indicated the amplification of non-genetically modified crops and other non-target transgenic crops图2 转基因玉米MIR604扩增的特异性Fig.2 The specialty of amplification of genetically modified maize MIR604

表2检测样品(1%，CRM)转基因玉米MIR604结构特异片段定量检测结果

Table2Quantitative detection result of event-specific fragment of genetically modified maize MIR604

分子片段MolecularfragmentCt值平均值MeanofCtvalueCt值标准偏差SDCt值相对标准偏差RSD/%绝对含量平均值Meanofabsolutecontent绝对含量标准偏差SD绝对含量相对标准偏差RSD/%测量值Measuredvalues/%偏差Biase/%MIR604分子片段MolecularfragmentofMIR60431.9840.0470.1473.4580.1133.2681.077内源基因zSSⅡbEndogenousgenezSSⅡb23.3280.1200.514321.44225.0407.790

A， MIR604品系特异性定量PCR扩增曲线；B， 玉米内源基因zSSIIb定量PCR扩增曲线；C， MIR604品系特异性定量PCR标准曲线；D， 玉米内源基因zSSIIb定量PCR标准曲线。

A， The amplification curve for the MIR604 event-specific assay; B， The amplification curve for thezSSIIb; C， The standard curve for the MIR604 event-specific assay; D， The standard curve for thezSSIIb gene assay.

图3 品系特异性定量PCR方法的扩增曲线和标准曲线Fig.3 The amplification and standard curves for the event-specific quantitative PCR method

2.4 方法的灵敏度

为了确认方法的灵敏度，分别以不同拷贝数的DNA为模板进行实时扩增，8次重复都有扩增信号的最低外源片段分子拷贝数为本方法的检测下限。结果(表3)表明，本方法最低能检测到0.012 ng的MIR604分子片段，平均Ct值为39.356。经计算检测下限约为5个拷贝的MIR604核酸分子片段。

表3转基因玉米MIR604结构特异片段灵敏度检测结果

Table3The sensitive detection result of event-specific fragment of genetically modified maize MIR604

DNA的量AmountofDNA/ng外源片段分子拷贝数CopiesofexogenousmolecularfragmentsCt值平均值MeanofCtvalue标准偏差SD相对标准偏差RSD/%0.1848034.9610.2100.6010.0924036.0970.3070.8500.0462037.2280.3440.9240.0231038.4220.4011.0440.012539.3560.2250.572

3 讨论

以PCR技术为基础的转基因成分检测根据PCR引物设计位点不同，可分为筛查法、基因特异性方法、结构特异性方法和品系特异性方法。品系特异性方法引物设计通常在外源载体和受体植物基因组分别设计上下游引物，可以区分相同转化载体的不同转化事件，同时鉴定出外源载体结构和受体植物品种，因此品系特异性方法应用广泛。常见的转基因水稻品种TT51-1、科丰6号[7-8]，转基因玉米品种NK603、MON863、98140、MIR612[9-12]，转基因油菜品种GT73[13]等都已研发了相应的品系特异性方法。转基因玉米MIR604投放市场后，欧盟、日本和韩国先后建立了本国MIR604实时荧光定量PCR检测方法，并且欧盟在此基础上建立起了MIR604荧光定量检测标准。日本和韩国科学家[14-15]建立了MIR604品系特异荧光定量检测方法，准确度方面日本科学家不同浓度的MIR604定量检测结果偏差在20%～40%，韩国科学家检测结果偏差在0～9%。灵敏度方面日本科学家建立方法的检测下限为0.5%，韩国科学家建立方法的检测下限为0.1%。目前，我国尚无MIR604的定量检测标准，本试验建立的MIR604品系特异性定量检测方法在左侧边界序列和玉米基因组连接处设计定量 PCR引物和探针，对6类非转基因作物和常见非目标转基因作物均无非特异扩增，具有较好的特异性。采用该方法所建立的标准曲线斜率在-3.6～-3.1，扩增效率在90%～110%，相关系数大于0.99，待检样品的定量检测结果为1.07%，检测结果的偏差为7%，符合欧盟荧光定量准确度相关标准[16]。参照我国农业部行业现有定量标准[17]，将检测下限换算为外源片段的拷贝数，本方法最低能检测到含量为5个拷贝的MIR604分子片段，具有较好的灵敏度。因此，本试验所建立的转基因玉米MIR604品系特异性实时荧光定量PCR检测方法可以在检测工作中推广应用。

[1] JAMES C. Global status of commercialized biotech/GM crops 2012[C]// ISAAA Briefs brief 44. Ithaca: International Service for the acquisition of Agri-Biotech Applications， 2013.

[2] 袁美妗，邓日强，胡晓晖，等. 苏云金芽孢杆菌Cry1Aa和Cry3A 结构域编码区的融合[J].农业生物技术学报，2002，10(3)：287-290.

YUAN M J， DENG R Q， HU X H， et al. Fusion ofBacinusthuringiensistoxinCry1Aa andCry3A domain encoding sequence[J].JournalofagriculturalBiotechnology， 2012，10(3):287-290.(in Chinese with English abstract)

[3] 抗虫玉米MIR604及其衍生品种定性PCR方法: 农业部1485号公告-16-2010 [S]. 北京：中国农业出版社，2015.

[4] Event-specific method for the quantification of maize line MIR604 using real-time PCR v. 1.01[S/OL].[2013-11-06]. https://publications.europa.eu/en/publication-detail/-/publication/52caee36-c915-4bcd-8b14-4ddabda68683

[5] 转基因产品检测核酸定量PCR检测方法: GB19495.5-2004 [S]. 北京：中国标准出版社，2007.

[6] SCHOLTENS I M J， KOK E J， HOUGS L， et al. Increased efficacy for in-house validation of real-time PCR GMO detection methods[J].Analytical&BioanalyticalChemistry， 2010， 396(6): 2213-2227.

[7] WU G， WU Y H， NIE S J， et al. Real-time PCR method for detection of the transgenic rice event TT51-1[J].FoodChemistry， 2010， 119(1):417-422.

[8] 王渭霞，赖凤香，洪利英，等. 实时定量PCR检测转基因水稻科丰6号插入拷贝数和转基因含量[J]. 农业生物技术学报，2012，20(1)：9-15.

WANG W X， LAI F X， HONG L Y， et al. Copy number estimation and quantitative analysis of transgenic rice Kefeng 6 through real-time PCR strategies[J].JournalofAgriculturalBiotechnology， 2012， 20(1): 9-15.(in Chinese with English abstract)

[9] LI X， SHEN K L， YANG L T， et al. Applicability of a novel reference molecule suitable for event-specific detections of maize NK603 based on both 50 and 30 flanking sequences[J].FoodControl， 2010， 21(6):927-934.

[10] 宋君，雷绍荣，刘勇，等. 转基因玉米MON863品系特异定量PCR方法的建立[J]. 湖北农业科学，2011，50(24)：5250-5253.

SONG J， LEI S R， LIU Y， et al. Establishment of constructing specific quantitative PCR of genetically modified maize(ZeamaysL.)event MON863[J].SouthwestChinaJournalofAgriculturalSciences， 2011，50(24):5250-5253. (in Chinese with English abstract)

[11] ZHANG F L， SONG J， NIU B， et al. An event-specific qualitative and real-time PCR detection of 98140 maize in mixed samples[J].FoodControl， 2015， 57:1-8.

[12] 张广远，孙红炜，李凡，等. 转基因玉米 MIR162 转化事件特异性检测方法及其标准化[J].作物学报，2013，39(7)：1141-1147.

ZHANG G Y， SUN H W， LI F, et al. Event-specific PCR detection method of genetically modified maize MIR162 and its standardization[J].ActaAgronomicaSinica， 2013， 39(7): 1141-1147. (in Chinese with English abstract)

[13] TIGST D， INDIRA R. Multiplex qualitative PCR assay for identification of genetically modified canola events and realtime event-specific PCR assay for quantification of the GT73 canola event[J].FoodControl， 2008， 19:893-897.

[14] MANO J， FURUI S， TAKASHIMA K， et al. Development and validation of event-specific quantitative PCR method for genetically modified maize MIR604[J].ShokuhinEiseigakuZasshi.JournaloftheFoodHygienicSocietyofJapan， 2012， 53(4): 166-171.

[15] KIM J H， KIM H Y. Event-specific detection methods for genetically modified maize MIR604 using real-time PCR[J].FoodScienceandBiotechnology， 2009， 18(5): 1118-1123.

[16] Definition of minimum performance requirements for analytical methods of GMO testing[S/OL].[2015-10-20]http://gmo-crl.jrc.ec.europa.eu/doc/MPR%20Report%20Application%2020_10_2015.pdf

[17] 转基因植物及其产品成分检测 抗虫水稻TT51-1及其衍生品种定量PCR方法: 农业部2122号公告-8-2014[S]. 北京：中国农业出版社，2015.

(责任编辑张 韵)

Areal-timefluorescentquantitativePCRfordetectionofgeneticallymodifiedmaizelineMIR604

CHANG Lijuan， SONG Jun*， ZHANG Fuli， LIU Wenjuan， TANG Chunyan， WANG Dong， YIN Quan

(AnalysisandTestCenter，SichuanAcademyofAgriculturalSciences，Chengdu610066，China)

Genetically modified maize MIR604 is an insect resistant maize line developed by Syngenta in 2005， which was approved as a raw material for food and feed processing in 2008 in China. In order to accurately detect MIR604 and its processing products， event-specific quantitative PCR detection method was established in this study. The PCR primers and probes were designed specially according to the left boundary sequence of MIR604 and maize genome sequence. Finally， we used the method to detect 6 kinds of non-genetically modified crops， MIR604 and other non-target transgenic crops. The results showed that the other samples apart from MIR604 were not detected. The measured value of the sample(CRM) containing 1% MIR604 was 1.07%， which was close to the real value (1%). The sensitivity experiment results indicated the method could detect only 5 copies of MIR604 molecular fragments. Thus， the event-specific quantitative PCR detection method of genetically modified maize MIR604 has high specificity， accuracy and sensitivity， which can be used for quantitative detection of genetically modified maize MIR604.

genetically modified maize MIR604; real-time fluorescent quantitative PCR; specificity; accuracy; sensitivity

常丽娟，宋君，张富丽，等. 实时荧光定量PCR方法检测转基因玉米MIR604[J].浙江农业学报，2017，29(11)： 1769-1774.

10.3969/j.issn.1004-1524.2017.11.01

2017-04-07

四川省质监局标准化技术体系(ZYBZ2013-39)

常丽娟(1982—)，女，四川巴中人，硕士，助理研究员，从事转基因生物安全监管研究。E-mail: juanjuanclj@126.com

*通信作者，宋君，E-mail: drsjn@126.com

S513

A

1004-1524(2017)11-1769-06