毛榛榛仁肽的氨基酸营养组成与总还原能力评价

郭庆启 张 娜 符 群 邹传山 张 智

(东北林业大学林学院1，哈尔滨 150040) (哈尔滨商业大学食品工程学院2，哈尔滨 150076)

毛榛榛仁肽的氨基酸营养组成与总还原能力评价

郭庆启1张 娜2符 群1邹传山1张 智1

(东北林业大学林学院1，哈尔滨 150040) (哈尔滨商业大学食品工程学院2，哈尔滨 150076)

以超临界CO2脱脂制备出的毛榛榛仁粕为原料，经Alcalase碱性蛋白酶水解榛仁粕蛋白提取液后，采用葡聚糖凝胶G-25对水解液进行分离纯化，得到Ⅰ和Ⅱ2种榛仁多肽组分，测定其氨基酸组成，并对其营养和总还原能力进行了评价。研究结果表明：对于毛榛榛仁多肽组分Ⅰ和Ⅱ，其氨基酸比值系数分值分别为36.15和41.11，营养价值较低，限制氨基酸分别是赖氨酸和亮氨酸。抗氧化实验结果表明，在相同质量浓度条件下，多肽组分Ⅱ的总还原能力要高于多肽组分Ⅰ，但均小于VC。

榛仁肽 氨基酸组成 营养评价 抗氧化

榛子为桦木科(Corylaceae)榛属(Corylus)植物[1]，榛子营养丰富，富含油脂、蛋白质、碳水化合物、维生素和矿物质[2-3]，以及人体所需的8种必需氨基酸和微量元素[4]。据《开宝本草》记载：“榛子益气力，实肠胃，令人不饥，健行”。世界榛子产量居前列的国家有土耳其、意大利、西班牙和塞浦路斯等，目前我国有22个省(区)有榛属分布，仅东三省就有榛林170万 m2[5]。黑龙江省的榛属资源主要有平榛和毛榛，毛榛产于黑龙江省的小兴安岭、张广才岭、老爷岭和完达山山脉。毛榛果皮薄，出仁率高，果仁香甜可口，品质优良，是重要的生食和食品加工的坚果原料之一[6-7]。目前，国内对于毛榛仍是传统的食用方式，即焙炒后去壳食用，对于榛仁的加工几乎是空白，亟需研究榛仁精深加工及高附加值产品的开发。

榛仁中蛋白质含量较高，但目前国内对于榛仁蛋白研究主要集中在分离提取及理化性质的分析[8-10]，而国外则集中在过敏源方面的研究[11]，国内有研究人员进行了榛仁肽水解条件的优化以及抗氧化、降血脂和抗疲劳等功能性质的研究，但研究对象均为酶解后制备出的酶解物，是一种多肽的混合物，而本文通过葡聚糖凝胶Sephadex G-25对酶解后的水解液进行分离纯化，对富集得到的榛仁多肽组分，依据氨基酸比值系数和FAO/WHO氨基酸评分标准[12]，进行了相关的营养评价并考察了其总还原能力[13]，以及进一步研究氨基酸组成和分子质量大小与榛仁肽抗氧化活性之间的联系，为毛榛榛仁的高值化加工利用提供依据。

1 材料和方法

1.1 原料和试剂

毛榛(Corylusmandshurica)：黑龙江省伊春市五营林业局，采集时间为当年9月份；Alcalase碱性蛋白酶(30000 U)：丹麦Novo Nordisk公司；其他试剂为分析纯。

1.2 仪器与设备

44C2-A型冷冻干燥机：北京博医康实验仪器有限公司；HA221-50-60型超临界CO2萃取装置：江苏南通华安超临界萃取有限公司；TU-1800SPC紫外-可见分光光度计：北京普析通用仪器有限公司；PHS-3C型酸度计：上海雷磁仪器厂；Kjeltec2300型定氮仪：瑞典Foss公司；HITACHI835-50氨基酸分析仪：日本HITACHI公司。

1.3 试验方法

1.3.1 脱脂榛仁粕的制备

将榛子手工去壳剥红衣，用粉碎机将榛仁粉碎后采用超临界CO2进行脱脂，超临界CO2萃取脱脂的条件为：萃取温度50 ℃、压力20 MPa、萃取时间3 h，将脱脂榛仁粕在40 ℃条件下烘干，过60 目筛后置于封口袋中低温保存。测得脱脂榛仁粕的蛋白质质量分数为(76.72±0.14)%。

1.3.2 榛仁蛋白水解液的制备

称取一定质量的脱脂榛仁粕粉末，按1∶35料液比加入蒸馏水搅拌溶解，在100 ℃条件下处理30 min后冷却，按3720 U/g加入Alcalase碱性蛋白酶，酶解温度50.6 ℃、酶解pH 8.4、采用NaOH溶液和恒温水浴保持体系的pH值和温度恒定，酶解90 min后沸水浴灭酶，离心分离得榛仁蛋白水解液[14]。

1.3.3 榛仁肽的分离纯化

将酶解得到的榛仁蛋白水解液，通过葡聚糖凝胶Sephadex G-25柱层析进行分离纯化，采用N2000色谱工作站进行在线检测和收集，设定检测波长280 nm，流速0.5 mL/min，将出现信号的洗脱液收集并真空冻干。

1.3.4 氨基酸的测定

氨基酸的检测方法采用GB/T 5009.124—2003，平行测定2次，以平均值作为试验结果。

1.3.5 榛仁肽氨基酸组成的营养评价

世界卫生组织(WHO)和联合国粮农组织(FAO)于1973年提出了评价蛋白质营养价值的氨基酸模式[15]，其主要采用以下指数和公式进行计算：

必需氨基酸比值(ratio of essential amino acid，REAA)=待评蛋白质中某种必需氨基酸含量(mg/g)/(WHO/FAO)模式中相应必需氨基酸的含量(mg/g蛋白)

氨基酸比值系数(ratio coefficient of amino acid，RC)=必需氨基酸比值/必需氨基酸比值的均值

氨基酸比值系数分值(score of RC，SRC)=100-CV×100

式中：CV为RC的变异系数，CV=标准差/均值。

1.3.6 榛仁肽组分的总还原能力评价

采用分光光度法进行总还原能力的测定[16]并略有改动，将浸提溶剂由甲醇改为水，并采用水溶液作参比调零。重复试验3次，以平均值±标准差结果作图。

2 结果和讨论

2.1 榛仁多肽的分离纯化

采用葡聚糖凝胶Sephadex G-25柱层析分离榛仁蛋白水解液的谱图见图1。经4次平行试验，层析谱图均出现2个峰，表明Sephadex G-25可以将榛仁蛋白水解液分离成2种主要组分。先洗脱下来的相对分子质量较大的称其为榛仁多肽组分Ⅰ，后洗脱下来的相对分子质量比较小的称其为榛仁多肽组分Ⅱ。王晶[5]采用酶解制备榛仁蛋白水解物，经凝胶柱分析得到2个峰，根据榛仁肽分子质量分布曲线判断水解反应是连续进行的，并估算出大多数榛仁肽的分子质量低于5 000 ku。

图1 榛仁蛋白水解液的层析谱图

2.2榛仁多肽组分的氨基酸组成分析和营养学评价

经氨基酸自动分析仪测定的2种多肽组分的氨基酸组成如表1所示。

表1 榛仁多肽组分的氨基酸组成及含量

多肽组分Ⅰ中氨基酸含量最多的是谷氨酸，占氨基酸总量的11.23%，苯丙氨酸含量第二，占氨基酸总量的10.50%。其中必需氨基酸占氨基酸总量的38.05%，接近FAO/WHO规定的40%标准比例，非必需氨基酸的含量占氨基酸总量的61.95%，高于FAO/WHO标准规定的60%[15]，说明多肽组分I的氨基酸组成较接近理想蛋白质的要求。多肽组分Ⅱ中氨基酸含量最高的是胱氨酸，占氨基酸总量的15.27%，这一含量与多肽组分I具有明显的区别；谷氨酸含量第二，占氨基酸总量的11.89%。其中必需氨基酸占氨基酸总量的34.19%，对比于多肽组分Ⅰ，要低于FAO/WHO标准。必需氨基酸含量的高低及构成比例是决定氨基酸营养价值的重要因素，从这一指标对比分析可知，多肽组分Ⅰ的营养价值要高于多肽组分Ⅱ。

表2 榛仁多肽组分的必需氨基酸比值、氨基酸比值系数及氨基酸比值系数分

评价蛋白质的营养价值可以分为两类，一类为动物试验，如生物价、蛋白质功效比值等[17]；另一类为化学分析法，常用的是氨基酸评分，而氨基酸比值系数法是基于氨基酸平衡理论设计的评价蛋白质营养价值的方法[18]。现代营养学理论认为，氨基酸的组成与其营养价值密切相关。蛋白质的氨基酸组成越接近于人体蛋白质的组成，在消化吸收时其营养价值越高[19]。对于2种多肽组分，根据氨基酸的种类和含量，计算出的必需氨基酸比值、氨基酸比值系数和比值系数分如表2所示。

RC的意义是与模式氨基酸相当量的一份食物氨基酸的比值，如果食物中氨基酸组成与氨基酸模式一致，则各比值系数都应等于1[20]。数值大于和小于1都表示偏离氨基酸模式，RC>1表示该氨基酸相对过剩，RC<1表示该氨基酸相对不足，RC最小的氨基酸则是限制氨基酸。从表2可知多肽组分Ⅰ中限制氨基酸为赖氨酸，多肽组分Ⅱ的限制氨基酸为亮氨酸。

现代研究认为不仅氨基酸不足影响蛋白质营养价值，氨基酸过剩同样也限制蛋白质营养价值。SRC的意义为[18]：如果食物蛋白质的氨基酸组成与氨基酸模式一致，则CV=0，SRC为100。当食物蛋白质的RC越分散，表示这些氨基酸在氨基酸平衡上做的负贡献越大，则CV变大，SRC变小，蛋白质的营养价值越差。通过计算可得组分Ⅰ和组分Ⅱ的SRC值分别为36.15和41.11，说明水解之后得到的2种多肽组分，营养价值低于多数的食品蛋白质[22-22]。

研究人员发现榛仁肽具有溶解性不随pH值变化而变化和高浓度低黏度的理化性质，并进一步研究发现榛仁肽具有降血脂和抗疲劳的功能，但对抗氧化功能的研究较少。抗氧化肽是目前国内外研究较多的一种生物活性肽，大部分研究者认为，抗氧化肽通常会包含特定类型的氨基酸，同时氨基酸的种类、序列、构型会决定着其抗氧化能力[22]，2种多肽组分中不同种类的氨基酸组成和含量如表3所示。

表3 2种榛子仁多肽中不同种类氨基酸的组成分析/mg/g蛋白

注：a为甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、脯氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸；b为丝氨酸、苏氨酸、胱氨酸、酪氨酸；c为赖氨酸、精氨酸、组氨酸；d为天门冬氨酸、谷氨酸；e为蛋氨酸；f为苯丙氨酸、酪氨酸。

2.3 榛仁多肽组分的总还原能力测定

由图2可知，无论是VC还是2种榛仁多肽组分，随着质量浓度的增加其总还原能力均呈现增加的趋势，呈现出一定的剂效关系。在相同质量浓度条件下，多肽组分Ⅱ的的总还原能力要高于多肽组分Ⅰ，但均小于VC。

图2 2种多肽组分和VC的总还原能力

李京京等[24]研究发现，随着浓度的升高，榛子抗氧化肽的还原能力逐渐增强，能够达到同浓度下EDTA的38.55%。研究认为，某些特定的氨基酸有可能成为抗氧化肽的活性位点，包括亲核性的含硫氨基酸，芳香族氨基酸以及含咪唑基的氨基酸。从表3可以看出，多肽组分Ⅱ的特征性氨基酸的数量要高于多肽组分Ⅰ，2种多肽组分的氨基酸含量存在差异，直接影响了其总还原能力的不同。

KATO等[25]认为芳香族氨基酸可供氢，减慢或终止自由基链式反应，而自身可以通过共振维持稳定，而极性氨基酸可以通过螯合金属离子来发挥其抗氧化能力。多肽组分Ⅱ中的疏水性的丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸的含量均高于多肽组分Ⅰ，而这些氨基酸的非极性脂肪烃侧链能使肽与疏水性多不饱和脂肪酸的相互作用增强，含疏水性氨基酸的肽片段通过与氧结合或抑制脂质中氧的释放来延缓脂质过氧化链式反应[26]。

从分子质量大小角度分析来看，多肽组分Ⅱ的分子质量要小于多肽组分Ⅰ，推断水解度对产物的抗氧化能力具有一定的影响，即水解度越大，产物的抗氧化能力越强，因此为了制备出抗氧化能力更强一些的榛仁肽，应加大对水解度的优化以及复合酶的应用研究。

3 结论

通过分析2种毛榛榛仁多肽组分的氨基酸组成及含量，发现其限制性氨基酸分别是赖氨酸和亮氨酸，计算出氨基酸比值系数分别为36.15和41.11，表明2种多肽组分的营养价值较低；但总还原能力试验结果表明，这2种多肽组分均具有一定的抗氧化能力，且多肽组分Ⅱ的总还原能力要高于多肽组分Ⅰ，但二者均小于VC。

[1]Ma H, Lu Z Q, Liu B B, et al. Transcriptome analysis of a Chinese hazelnut speciesCorylusmandshurica[J]. BMC Plant Biology, 2013, 13:152-162

[2]田文翰，梁丽松，王贵禧. 不同品种榛子种仁营养成分含量分析[J]. 食品科学，2012，33(8)：265-269

Tian W H, Liang L S, Wang G X. Nutrient composition analysis of hazelnut kernel from different varieties [J]. Food Science, 2012，33(8)：265-269

[3]祝美云，田文瀚，梁丽松，等. 不同种类榛子油脂脂肪酸组成及抗氧化活性[J]. 食品科学，2012，33(23)：47-50

Zhu M Y, Tian W H, Liang L S, et al. Fatty acid composition and antioxidant activity of kernel oils from different hazelnut varieties [J]. Food Science, 2012，33(23)：47-50

[4]马勇，周佩. 榛子粉的主要成分和功能特性研究[J]. 食品与发酵工业，2008，34(11)：72-75

Ma Y, Zhou P. Main components and functional characters of filbert powder [J]. Food and Fermentation Industries, 2008，34(11)：72-75

[5]王晶. 榛仁肽的制备及特性研究[D]. 长春：吉林农业大学，2006

Wang J. The preparation of hazelnut peptide and the study on its speciality[D]. Changchun: Jilin Agricultural University,2006

[6]张宇和，柳鎏，梁维坚. 中国果树志：板栗榛子卷[M]. 北京：中国林业出版社，2005:190-200

Zhang Y H, Liu L, Liang W J. Chinese fruit trees records: chestnut hazelnut roll[M]. Beijing：China Forestry Publishing House，2005:190-200

[7]龙作义，鲁昌华. 黑龙江省榛子资源分布状况与开发利用研究的进展[J]. 中国林副特产，2005,8(4)：41-42

Long Z Y, Lu C H. Resourse distribution and development research progress of corylus in Heilongjiang province [J]. Forest By-Product and Speciality in China, 2005,8(4)：41-42

[8]马勇，张丽娜，齐凤元，等. 榛子蛋白质提取及功能特性研究[J]. 食品科学，2008，29(8)：318-322

Ma Y, Zhang L N, Qi F Y, et al. Study on extraction of hazelnut protein and its functional properties [J]. Food Science, 2008，29(8)：318-322

[9]Tatar F, Tunc M T, Kahyaoglu T. Turkish tombul hazelnut(Corylus avellana L.) protein concentrates: functional and rheological properties[J]. J Food Sci Technol，2015，52(2)：1024-1031

[10]李杨，江连洲，王胜男，等. 水酶法提取榛子蛋白工艺优化[J]. 食品科学，2012，33(2)：143-147

Li Y, Jiang L Z, Wang S N, et al. Process optimization for aqueous enzymatic extraction of filbert protein [J]. Food Science, 2012，33(2)：143-147

[11]Cucu T, Platteau C, Taverniers, et al. Effect of partial hydrolysis on the hazelnut and soybean detectability by ELISA [J]. Food Control， 2013(30)：497-503

[12]朱圣陶，吴坤. 蛋白质营养价值评价——氨基酸比值系数法[J]. 营养学报，1988，10(2)：187-190

Zhu S T, Wu K. Nutritional evaluation of protein-ratio coefficient of amino acid [J]. Acta Nutrimenta Sinica, 1988，10(2)：187-190

[13]朱夕波，周培根，李燕，等. 猪皮胶原蛋白水解产物中抗氧化活性肽的分离及其氨基酸组分[J]. 天然产物研究与开发，2009,21：122-124,182

Zhu X B, Zhou P G, Li Y, et al. Separation of antioxidative peptides from porcine collagen hydrolysis and its analysis of amino acid composition[J]. Natural Product Research and Development, 2009,21：122-124,182

[14]郭庆启，张娜，姜元松，等. 榛子仁蛋白酶解工艺的优化及酶解物[J]. 食品科学，2013，34(9)：189-193

Guo Q Q, Zhang N, Jiang Y S, et al. Optimization of enzymatic hydrolysis of hazelnut kernel protein and antioxidant capacity of its hydrolysate [J]. Food Science, 2013，34(9)：189-193

[15]吴晓红，王振宇，郑洪亮，等. 红松仁蛋白氨基酸组成分析及营养评价[J]. 食品工业科技，2011，32(1)：267-270

Wu X H, Wang Z Y, Zheng H L, et al. Study on content of amino acid in the pine seed protein and its nutritive evaluation [J]. Science and Technology of Food Industry, 2011，32(1)：267-270

[16]郭庆启, 张娜, 李梦云, 等. 落叶松松塔成分、抗氧化能力与海拔高度的相关性研究[J]. 北京林业大学学报, 2013, 35(1): 59-63

Guo Q Q, Zhang N, Li M Y, et al. Relationship between polyphenols and antioxidation in larch pine cones and altitude [J]. Journal of Beijing Forestry University, 2013, 35(1): 59-63

[17]郑慧娜，张超桦，吉宏武，等. 马氏珠母贝高F值寡肽初步分离纯化及氨基酸组成分析[J]. 食品与发酵工业，2011,37(6)：47-50

Zheng H N, Zhang C H, Ji H W, et al. Preliminary separation and the amino acid composition ofpinctadamartensiimeat protein hydrolysate with a high fisher ratio[J]. Food and Fermentation Industries, 2011,37(6)：47-50

[18]蔡联辉，曾虹燕，王亚举，等. 莲子蛋白质的氨基酸组成及其营养评价[J]. 营养学报，2010,32(5)：503-506

Cai L H, Zeng H Y, Wang Y J, et al. The amino acid contents of lotus seed protein and its nutritional evaluation[J]. Acta Nutrimenta Sinica, 2010,32(5)：503-506

[19]李华，刘恩岐，唐仕荣，等. 酶法制备黑豆抗氧化肽及其分离纯化与氨基酸组成分析[J]. 食品科学，2013,34(09)：271-276

Li H, Liu E Q, Tang S R, et al. Enzymatic preparation, purification and amino acid composition of antioxidant peptides from black soybeans[J]. Food Science, 2013,34(09)：271-276

[20]余传隆. 氨基酸与人类健康[J]. 氨基酸和生物资源，1999，21(4)：4-8

Yu C L. Amino acid and human health[J]. Amino Acid and Biotic Resources，1999，21(4)：4-8

[21]洪鹏志，杨萍，张超桦，等. 黄鳍金枪鱼头酶解蛋白粉营养评价及其应用[J]. 食品工业科技，2007，04：210-212

Hong P Z, Yang P, Zhang C H, et al. Nutritional evaluation and application of yellow fin tuna head enzymolysis protein powder [J]. Science and Technology of Food Industry，2007(4)：210-212

[22]任海伟，王常青. 黑豆低聚肽的抗氧化活性评价及其氨基酸组成分析[J]. 食品与发酵工业，2009，35(9)：46-50

Ren H W, Wang C Q. Amino acid composition analysis and antioxidant activity evaluation of oligopeptides from black soybean[J]. Food and Fermentation Industries, 2009，35(9)：46-50

[23]张晖，唐文婷，王立，等. 抗氧化肽的构效关系研究进展[J]. 食品与生物技术学报，2013，32(7)：673-679

Zhang H, Tang WT, Wang L, et al. Review on structure-activity relationship of antioxidative peptides[J]. Journal of Food Science and Biotechnology, 2013，32(7)：673-679

[24]李京京，孙文佳，闵伟红. 长白山榛子抗氧化肽制备及其活性研究[J]. 食品研究与开发，2016,37(10)：1-5

Li J J, Sun W J, Min W H. Preparation and activity of antioxidant peptide from hazelnut in changbai mountain[J]. Food Research and Develop，2016,37(10)：1-5

[25]Kato N, Sato S, Yamanaka A. Silk protein, sericin, inhibits lipid peroxidation and tyrosinase activity[J]. Biosci.Biotechnol.Biochem，1998,62(1)：145-147

[26]程云辉，曾知音，郭建伟，等. 抗氧化肽的酶法制备及其构效关系的研究进展[J]. 食品与机械，2009，25(6)：174-180

Cheng Y H, Zeng Z Y, Guo J W, et al. Preparation and structure-activity relationship of antioxidant peptides[J]. Food and Machinery, 2009，25(6)：174-180.

Evaluation of Amino Acid Nutritional Composition and Total Reducing Power ofCorylusMandshuricaMaxim Hazelnut Peptides

Guo Qingqi1Zhang Na2Fu Qun1Zou Chuanshan1Zhang Zhi1

(School of Forestry,Northeast Forestry University1, Harbin 150040) (College of Food Engineering, Harbin University of Commerce2,Haerbin 150076)

The protein extraction solution from the supercritical carbon dioxide defattedcorylusmandshuricakernel meal was hydrolyzed by Alcalase, and then the hydrolysate was separated and purified by Sephadex G-25. After that two kernel polypeptide fractions I and II were prepared,the amino acid composition of thetwo polypeptide fractions was determined, and its nutrition and total reducing power were evaluated. The results showed that, for polypeptide fractions I and II, the score of ratio coefficient of amino acid was 36.15 and 41.11 each, which showed that the nutritional value wasrelatively low; the limiting amino acidswere Lysine and Leucine for two fractions, respectively. The antioxidant experiment results show that under the same concentration, the total reducing power of polypeptide fraction II was higher than that of polypeptide fraction I, but both were less than that of VC.

hazelnut peptide, amino acid composition, nutrition evaluation, antioxidation

S664.4

A

1003-0174(2017)11-0064-06

中央高校基本科研业务费专项资金(DL12BA04)，东北林业大学食品工程原理重点课程资助(DL 2015-26)，中国食品科学技术学会食品科技基金-贝因美食品科技研究基金(2016-002)

2016-05-25

郭庆启，男，1978年出生，副教授，天然产物化学