人肝细胞生长因子重组腺病毒枕大池注入对动脉粥样硬化大鼠脑组织IL-6、TNF-α表达的影响

郭寒冰，孙允芹，禹萌，赵爽,李彤

(新乡医学院第一附属医院，河南卫辉453100)

人肝细胞生长因子重组腺病毒枕大池注入对动脉粥样硬化大鼠脑组织IL-6、TNF-α表达的影响

郭寒冰，孙允芹，禹萌，赵爽,李彤

(新乡医学院第一附属医院，河南卫辉453100)

目的观察人肝细胞生长因子重组腺病毒(Ad-HGF)枕大池注入对动脉粥样硬化大鼠脑组织IL-6、TNF-α表达的影响。方法60只15月龄SD雄性大鼠，随机抽取50只采用肾动脉狭窄术及高脂饲料喂养法制作动脉粥样硬化模型，造模成功大鼠20只;将造模成功大鼠随机分为动脉粥样硬化组、Ad-HGF组，各10只；另10只大鼠为对照组。对照组、动脉粥样硬化组大鼠通过枕大池注入生理盐水(10 μL)，Ad-HGF组大鼠通过枕大池注入Ad-HGF(10 μL，滴度5×109pfu/100 μL)；之后第10天处死大鼠，用免疫组织化学法检测大鼠脑组织中的IL-6及TNF-α，用image-proplus软件对IL-6及TNF-α在大鼠脑组织中的表达进行半定量分析，同时采用酶联免疫吸附法检测大鼠脑组织中的IL-6及TNF-α。结果免疫组织化学法检测显示，对照组、动脉粥样硬化组、 Ad-HGF组大鼠脑组织中的IL-6相对表达量分别为0.216 0±0.068 1、0.331 0±0.043 3、0.174 9±0.010 7，TNF-α相对表达量分别为0.078 6±0.011 2、0.255 1±0.045 8、0.054 4±0.016 6；与对照组相比,动脉粥样硬化组IL-6、TNF-α的表达增加(P均lt;0.05)；与动脉粥样硬化组相比，Ad-HGF组IL-6、TNF-α的表达减少(P均lt;0.05)。 酶联免疫吸附法检测显示，对照组、动脉粥样硬化组、 Ad-HGF组大鼠脑组织中的IL-6表达量分别为(50.415±6.690)、(108.302±5.695)、(66.062±9.550)pg/mL，TNF-α表达量分别为(83.836±9.442)、(209.425±15.520)、(85.996±8.445)pg/mL；与对照组相比,动脉粥样硬化组IL-6、TNF-α的表达增加(P均lt;0.05)；与动脉粥样硬化组相比，Ad-HGF组IL-6、TNF-α的表达减少(P均lt;0.05)。结论动脉粥样硬化大鼠脑组织IL-6、TNF-α的表达增加，Ad-HGF可以减少动脉粥样硬化大鼠脑组织IL-6、TNF-α的表达，即抑制动脉粥样硬化大鼠脑组织炎性反应。

人肝细胞生长因子重组腺病毒； 动脉粥样硬化； 脑组织； 炎性因子

动脉粥样硬化是造成血管狭窄、引起缺血性脑血管病的主要原因，尤其是血管多处狭窄和弥漫性狭窄。随着影像学技术的发展，小血管弥漫性狭窄、阻塞导致的缺血性脑血管病的诊断比较容易，但仍缺少有效的防治方法。人肝细胞生长因子重组腺病毒(Ad-HGF)作为一种新型的基因定植药物，在血管新生方面的作用引起临床医生的广泛关注[1，2]。研究发现，Ad-HGF能够抑制受损组织产生的炎性反应，对骨骼肌与心肌缺血有显著疗效并已进入临床Ⅱ期应用阶段[3，4]。在正常大鼠脑组织中，Ad-HGF由于携带的腺病毒感染定植于脑膜间皮细胞并分泌表达人肝细胞生长因子(HGF)，活性蛋白HGF可发挥促进内皮细胞增殖与迁移、血管新生和神经发生等生物学作用[5]。孙允芹等[6]研究证明在经枕大池注入Ad-HGF后动脉粥样硬化大鼠脑血流量明显改善。急性颅脑损伤及缺血性脑血管病患者的血清中IL-6、TNF-α表达明显增加，且随着疾病严重程度的上升而呈上升趋势[7]。2015年12月20日～2017年3月6日，我们观察了经枕大池注入Ad-HGF对动脉粥样硬化大鼠脑组织IL-6、TNF-α表达的影响。现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和仪器 Ad-HGF(滴度5×109pfu/100 μL)，高酯饲料(胆固醇、丙基硫氧嘧啶、胆酸钠、蛋白粉、蔗糖、蛋黄粉、猪油等)，一抗抗体兔抗鼠IL-6抗体，一抗抗体兔抗鼠TNF-α抗体，通用型二抗抗体，枸橼酸钠缓冲液，PBS冲洗液，IL-6酶联免疫吸附法试剂盒，TNF-α酶联免疫吸附法试剂盒，大鼠脑立体定位仪及大容量离心机。

1.2 实验动物、动脉粥样硬化动物模型制备及Ad-HGF给予方法 雄性SD大鼠60只(300～400 g)，15月龄，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，自由饮水摄食，饲养环境温度为19～20 ℃、空气湿度为50%～60%。从60只大鼠中随机抽取50只制作成动脉粥样硬化模型。动脉粥样硬化模型制备方法[7]：10%水合氯醛麻醉大鼠后固定，腹正中线偏左肋弓下缘2 cm处切开，找到左肾动脉，剥离左肾动脉并用血管线穿过肾动脉下方，同时放入0.35 mm左右的针灸针，将线打结后拔出针灸针，用同样方法处理右侧肾动脉，术后闭合腹腔(剔出术后感染死亡大鼠共11只)。普通饲料喂养2周后，测量大鼠血压(剔除不符合检验指标大鼠共9只),大鼠血压明显升高并高于正常上限。高血压造模成功1周后使用高脂饲料喂养(0.2%丙基硫氧嘧啶，2%胆固醇，5%猪油，0.25%白糖，0.35%胆酸钠等)16周。高血脂造模成功的标准：大鼠血脂升高并高于正常上限，大鼠颈内动脉HE染色后观察到其血管内皮细胞排列紊乱并有粥样斑块形成(剔除未达到高血脂标准的大鼠共10只)。造模成功的20只大鼠随机分为动脉粥样硬化组、Ad-HGF组。另10只大鼠作为对照组，对照组大鼠分离左右肾动脉，不实施肾动脉狭窄术,术后正常饲料喂养。对照组、动脉粥样硬化组大鼠通过枕大池注入生理盐水(10 μL)，Ad-HGF组大鼠通过枕大池注入Ad-HGF(10 μL，滴度5×109pfu/100 μL)；之后第10天处死大鼠，检测大鼠脑组织中的IL-6及TNF-α。

1.3 大鼠脑组织中IL-6及TNF-α检测方法 用10%水合氯醛腹腔麻醉大鼠后暴露大鼠心脏，从心尖部插入粗针头到达主动脉弓，同时剪开右心耳使静脉血流出，心脏灌注观察直到有清亮液体流出，随后4%多聚甲醛灌注固定大鼠脑组织后快速分离完整脑组织，取部分脑组织，置多聚甲醛固定液，24 h后制作蜡块，3 μm厚切片，于烘片机放置2～3 h。用免疫组织化学染色法检测脑组织切片中的IL-6、TNF-α，于镜下观察表达IL-6、TNF-α的神经元细胞，使用Image-proplus软件对IL-6、TNF-α进行半定量分析。另取大鼠新鲜脑组织，称重后液氮研磨、裂解、离心，取上清，用酶联免疫吸附试验检测IL-6、TNF-α。

2 结果

2.1 三组大鼠脑组织IL-6、TNF-α的免疫组织化学法检测结果 镜下见对照组脑组织中基本没有表达IL-6、TNF-α的神经元细胞，动脉粥样硬化组表达IL-6、TNF-α的神经元细胞较多，Ad-HGF组表达IL-6、TNF-α的神经元细胞较少(见图1、2)。IL-6、TNF-α的相对表达量见表1。

注：A为对照组；B为动脉粥样硬化组；C为Ad-HGF组

图1表达IL-6的神经元细胞(免疫组化染色，×200)

注：A为对照组；B为动脉粥样硬化组；C为Ad-HGF组

图2 表达TNF-α的神经元细胞(免疫组化染色，×200)

注：与对照组相比，*Plt;0.05；与动脉粥样硬化组相比，#Plt;0.05。

2.2 三组大鼠脑组织IL-6、TNF-α的酶联免疫吸附法检测结果 酶联免疫吸附法检测的三组大鼠脑组织IL-6、TNF-α表达量见表2。

表2 酶联免疫吸附法检测的三组大鼠脑组织IL-6、TNF-α表达量比较

注：与对照组相比，*Plt;0.05；与动脉粥样硬化组相比，#Plt;0.05。

3 讨论

HGF具有强烈的促进血管新生的作用[3,5]，不会引发组织水肿、低血压等问题[8]，对心脏组织没有明显的毒性和诱变作用。HGF也有促进脑组织血管新生的作用[9]，可以抑制由于脑组织损伤而产生的纤维化[10]，进而缓解由于脑供血不足导致的各种临床症状及后遗症。目前，我国已构建具有专利技术的腺病毒HGF载体，即 Ad-HGF，这是一种新型的基因定植药物，其腺病毒载体为E1、E3缺失体，避免了野生型腺病毒的复制[11，12]。体外实验[13]显示，将Ad-HGF重复注入心脏衰竭大鼠的心肌组织中，其心脏新生血管密度明显增加、心脏功能明显改善[14]。同时，Ad-HGF可有效感染脑膜间皮细胞，产生活性蛋白HGF，作用于缺血脑组织，发挥促血管新生作用，但要排除Ad-HGF对脑组织的损伤。

IL-6是由活化的T细胞产生的淋巴因子,可与集落刺激因子协同增强自然杀伤细胞的功能。激活的IL-6会损伤血管的内膜，继而增强血管内皮与血细胞的黏附性,引起大量自由基聚集、炎症介质增多，导致细胞溶解及死亡[15～17]。TNF-α是一种具有多种生物活性的细胞因子，是机体炎症反应及免疫应答的重要炎性递质[18，19]，通过介导炎症级联反应、破坏血脑屏障等诱导细胞凋亡[20，21]。在炎症反应及损伤组织中，IL-6与TNF-α表达增加[22，23]，特别在急性脑血管病患者的血清中IL-6、TNF-α的表达显著增加[24]。冠心病、脑梗死、颅内感染患者血清IL-6、TNF-α水平明显升高，且随着疾病严重程度升高而呈上升趋势[25]。因此，我们选择观察IL-6、TNF-α的表达变化来判断Ad-HGF对脑组织炎性反应的作用。我们的实验结果显示，动脉粥样硬化大鼠脑组织IL-6、TNF-α的表达明显增加，经枕大池注入Ad-HGF后大鼠脑组织IL-6、TNF-α的表达明显减少，这说明Ad-HGF可以减少与组织损伤有关的炎性因子IL-6、TNF-α的表达，即可以抑制脑组织的炎性反应，对脑组织发挥保护作用，这也为Ad-HGF进入临床使用提供了依据。

已有研究[13]发现，与单次注射相比，重复注射Ad-HGF，其作用会明显增强，下一步我们计划对不同剂量Ad-HGF的有效性和安全性及Ad-HGF不同作用时间的有效性与安全性进行观察。

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10.3969/j.issn.1002-266X.2017.43.011

R743

A

1002-266X(2017)43-0035-03

河南省医学科技攻关省部共建项目(201401012)。

李彤(E-mail： litong0833@163.com)

2017-06-10)