基于COⅠ及RAG2基因序列的我国科鱼类分子系统研究

苏国茂，林聪左，林贞武，黎幸有，梁日深，黄运银

( 1.仲恺农业工程学院 动物科技学院，广东 广州 510225；2.湖北生物科技职业学院，湖北 武汉 430070 )

苏国茂1，林聪左1，林贞武1，黎幸有1，梁日深1，黄运银2

( 1.仲恺农业工程学院 动物科技学院，广东 广州 510225；2.湖北生物科技职业学院，湖北 武汉 430070 )

近年来，随着分子生物技术的快速发展，应用合适的线粒体DNA及核DNA分子标记技术可在基因水平上有效解决鱼类形态分类上悬而未决的难题[9-12]。线粒体DNA中细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ(COⅠ)基因进化适中，已被验证为鱼类物种鉴定、分子系统发育研究中可靠的遗传标记。同时，COⅠ基因5′端一段长度为648 bp的片段，能在基因水平上成功区分物种，已被广泛应用于物种的分子鉴定[13]。重组激活基因(RAGs)是脊椎动物特异性免疫反应的关键基因，它由RAG1和RAG2两个基因组成，在引起V(D)J基因重排及淋巴系细胞发育过程中起到关键性作用[14-15]。其中，RAG2是可靠的核基因遗传标记，目前已经广泛应用于硬骨鱼类系统进化分析的研究[16-18]。

1 材料与方法

1.1 材料来源

表1 试验材料的种类和采集地

1.2 总基因组DNA的提取

基因组DNA采用动物组织DNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司)进行提取。提取的DNA溶解于100 μL灭菌水中，1%琼脂糖凝胶电泳检测提取质量，-20 ℃保存备用。

1.3 PCR扩增及序列测定

[16, 20]，选择用于扩增COⅠ基因及RAG2基因片段序列的引物分别为:

COⅠ-F1: 5′-TCA ACY AAT CAY AAA GAT ATY GGC AC -3′；

COⅠ-R1: 5′-ACT TCY GGG TGR CCR AAR AAT CA -3′[20]；

RAG2-F1: 5′-GAG GGC CAT CTC CTT CTC CAA-3′；

RAG2-R3: 5′-GAT GGC CTT CCC TCT GTG GGT AC-3′[16]。

PCR反应体系为50 μL，其中10×buffer 5 μL，dNTPs (各2.5 mmol/L)2 μL，上下游引物各1 μL，Ex Taq酶(1 U/μL) 2 μL。PCR反应条件为：

COⅠ基因：94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，60 ℃ 60 s，72 ℃ 90 s，35个循环，72 ℃ 10 min；

RAG2基因：94℃ 5 min，94 ℃ 30 s，55 ℃ 60 s，72℃ 90 s，35个循环，72 ℃ 10 min。

PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳分离，纯化后送上海英骏生物技术有限公司进行测序。……