中晚期宫颈鳞状细胞癌同步放化疗敏感性相关血清miRNA的临床研究

钱阅宬++++++张重寅++++++张鹏++++++周钗++++++吕晓娟

[摘要] 目的 探討中晚期宫颈鳞状细胞癌同步放化疗敏感性相关的血清miRNA。 方法 收集2014年2～12月在我院妇科接受根治性同步放化疗的20例中晚期宫颈癌患者为研究对象，按照患者治疗过程及随访过程中肿瘤评估的情况，将研究对象分为同步放化疗抗拒组（n=10）和同步放化疗敏感组（n=10），筛选抗拒组和敏感组间具有显著表达差异的miRNA，对比两组miR-136-5p、miR-152-3p、miR-206的表达情况。 结果 在芯片筛选出的miRNA中，抗拒组和敏感组之间具有显著表达差异的miRNA有3个：抗拒组相较敏感组低表达的为miR-136，抗拒组相较敏感组高表达的为miR-152和miR-206。标本定量验证结果显示，敏感组hsa-miR-136-5p的表达水平高于抗拒组，差异有统计学意义（P<0.01）；敏感组hsa-miR-206的表达水平低于抗拒组，差异有统计学意义（P<0.01）；敏感组和抗拒组hsa-miR-152-3p的表达水平，差异无统计学意义（P>0.05）。 结论 中晚期宫颈癌患者血清中miRNA-136的表达下调、miRNA-206的表达上调可能与同步放化疗抗拒有关。

[关键词] 宫颈鳞状细胞癌；miRNA；放疗；化疗；敏感性

[中图分类号] R737.33 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2017）31-0001-04

[Abstract] Objective To investigate the simultaneous chemoradiotherapy sensitivity related serum miRNAs of middle and advanced cervical squamous cell carcinoma. Methods A total of 20 patients with middle and advanced cervical squamous cell carcinoma who underwent radical concurrent radiotherapy and chemotherapy from February 2014 to December 2014 were enrolled in this study. According to the course of treatment and the evaluation of tumor during follow-up， the subjects were divided into simultaneous chemoradiotherapy resistant group（n=10） and simultaneous chemoradiotherapy sensitive group（n=10）. The miRNAs with significant difference in expression between the resistant group and the sensitive group were screened. The expressions of miR-136-5p， miR-152-3p and miR-206 were compared between the two groups. Results In the miRNA selected by chip， there were three miRNAs with significant difference between the resistant group and the sensitive group. The expression of miR-136 was lower in the resistant group than that in the sensitive group， and the expressions of miR-152 and miR-206 were higher than those of the sensitive group. Specimen quantitative verification results showed that the expression level of hsa-miR-136-5p in sensitive group was higher than that in resistant group， and the difference was significant（P<0.01）. The expression level of hsa-miR-206 in sensitive group was lower than that in resistant group， and the difference was statistically significant（P<0.01）. There was no significant difference in the expression level of hsa-miR-152-3p between sensitive group and resistant group（P>0.05）. Conclusion The downregulation of miRNA-136 and upregulation of miRNA-206 may be related to the resistance of the simultaneous chemoradiotherapy in patients with middle and advanced cervical squamous cell carcinoma.

[Key words] Cervical squamous cell carcinoma； miRNA； Radiotherapy； Chemotherapy； Sensitivityendprint

同步放化疗是中晚期宫颈癌常用的治疗方案，对降低中晚期宫颈癌的复发和病死风险具有重要价值[1-2]。部分中晚期宫颈癌患者在接受同步放化疗后，病情暂时得到控制，但不久仍会出现复发和转移[3]。目前中晚期宫颈癌放化疗的敏感性已得到足够重视，但具体机制目前尚未完全明晰，患者预后差，生存期明显缩短[4]。随着分子生物学的发展和进步及中晚期宫颈癌放化疗敏感性相关的生化因子不断被发现，其中与中晚期宫颈癌同步放化疗敏感性相关的血清miRNA也被不断重视[5-6]。本研究对此进行探讨，现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料

收集2014年2～12月在我院妇科接受根治性同步放化疗的20例中晚期宫颈癌患者为研究对象，经病理活检结果，患者肿瘤分期为Ⅱb-Ⅳa期，病理类型为宫颈鳞状细胞癌[7]。患者年龄35～80岁，平均（47.66±5.21）岁；病程3～5年，平均（2.32±0.64）年；其中5例患者有宫颈癌家族史。本项研究获我院伦理委员会审批通过。纳入标准[7]：（1）FIGO临床分期为Ⅱb～Ⅳa期；（2）同步放化疗前未接受过盆腔放疗与化疗；（3）KPS评分≥70分；（4）患者知情同意。排除标准[7]：（1）患有其他系统的恶性肿瘤患者；（2）患有不能耐受放化疗治疗的疾病患者；（3）患有精神疾病、严重肝肾疾病者。

1.2方法

1.2.1 治疗方法 对所有患者进行根治性同步放化疗。

1.2.2 分组标准 以同步放化疗完成后12个月为界，按照患者治疗过程及随访过程中肿瘤评估的情况，将研究对象分为同步放化疗抗拒组（n=10）和同步放化疗敏感组（n=10），两组患者基本资料比较，差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。见表1。

1.3标本的收集

采集所有患者清晨空腹血4 mL，3500 rpm轉速离心5 min，提取上清液-80 °C保存待测。

1.4实验方法

使用miRNA提取试剂盒进行miR-214抽提，实验过程按照试剂盒使用说明进行，抽提之后，使用核酸浓度检测仪检测RNA浓度和纯度，最后将其浓度稀释至50 μg/mL，使用特异性反转录引物进行cDNA合成，反应条件按照cDNA合成试剂盒使用说明进行设置。反应条件：95 ℃预变性10 min、95 ℃变性15 s、60 ℃退火32 s，循环50次后检测其溶解曲线，检测完成后，通过计算机系统自动分析各样本Ct值，然后采用2-ΔΔCt计算miRNA的相对表达量。实验重复3次。用Megaplex RT Primers反转录miRNA靶点及用可选的Megaplex PreAmp Primers预扩增之后，配制PCRMix，TaqMan MiRNA Array（A+B）上样，行标本定量验证，然后在7900HT定量PCR仪上运行分析。对比两组miR-136-5p、miR-152-3p、miR-206的表达情况。抗拒组和敏感组间差异表达的miRNA采用TaqMan miRNA表达谱芯片筛选。对miRNA芯片结果进行分析，以变化倍数Fold change>2.0或<0.5为标准，筛选出组间表达差异显著的miRNA。

1.5 统计学方法

所有的统计分析均采用SPSS 16.0软件包（SPSS，Chicago，IL）进行，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，执行方差分析或t检验；应用GraphPadPrism5软件进行统计图形制作。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1芯片筛选结果

共筛选出组间表达差异显著的miRNA 212个，以敏感组为对照，抗拒组显著高表达的miRNA有62个；抗拒组显著低表达的miRNA有150个。在芯片筛选出的miRNA中，抗拒组和敏感组之间具有显著表达差异的miRNA有3个：抗拒组相较敏感组低表达的是miR-136，抗拒组相较敏感组高表达的是miR-152和miR-206。芯片miRNA分布散点图见图1（Array A）及图2（Array B）。

2.2标本定量验证结果

标本定量验证结果显示，敏感组hsa-miR-136-5p的表达水平高于抗拒组，差异有统计学意义（P<0.01）；敏感组hsa-miR-206的表达水平低于抗拒组，差异有统计学意义（P<0.01）；敏感组和抗拒组hsa-miR-152-3p的表达水平，差异无统计学意义（P>0.05）。见表2。

3 讨论

最近很多研究已经显示了miRNA表达在多种恶性肿瘤中都有相应的监管机制，包括肺癌、肝癌、结肠癌、神经胶质瘤等[8-9]。其中某些miRNA已经被广泛认可是关键的致癌基因或抑癌基因[10]。目前恶性肿瘤的治疗方案中，放射治疗是常见的治疗方案之一，尤其是针对非小细胞肺癌，放射治疗是出现播散和转移后的有效首选方案，但是其对放射剂量的耐受和敏感性降低是目前临床上存在的主要问题[11]。曾有学者研究指出部分miRNA在恶性肿瘤的放射治疗过程中对肿瘤细胞的放疗敏感反应有一定的调控作用。然而，目前尚没有关于miR-214在肺癌细胞中的表达和与放射治疗相关性的研究。因此，我们在肺癌类型中选取了非小细胞肺癌细胞株进行miRNA分析和放疗敏感性的研究。

目前miRNA表达谱芯片技术已被用于临床miRNA差异化表达的筛选中，被证明具有高敏感度和特异度[12-14]。我们在研究中，将病例按照放化疗敏感性及是否出现抵抗分为敏感组和抗拒组，两组间病例基本资料匹配度良好，因此保证了两组间具有可比性。经使用miRNA表达谱芯片技术，我们筛选出miRNA-136、miRNA-152、miRNA-206这3组表达存在显著差异的miRNA。将miRNA-136、miRNA-152、miRNA-206进行扩大样本量行PCR检测，检测结果显示，敏感组和抗拒组间miRNA-152的表达不存在统计学差异，但敏感组和抗拒组间miRNA-136、miRNA-206的表达仍然存在一定的统计学差异。我们发现，对同步放化疗抗拒的中晚期宫颈癌患者血清miRNA-136呈低表达，而miRNA-206则呈高表达。表明miRNA-136、miRNA-206与中晚期宫颈癌同步放化疗敏感性具有一定的联系[15-16]。因此我们对miRNA-136、miRNA-206与中晚期宫颈癌同步放化疗敏感性的关系进行重点探讨。endprint

miRNA-136在不同类型的恶性肿瘤中发挥的作用不尽相同：在卵巢癌、肝癌等肿瘤组织中，miRNA-136低表达[17]，而在肺癌、乳腺癌等恶性肿瘤组织中，miRNA-136则呈现高表达[13]。有国外研究[12]显示，对顺铂耐药的卵巢上皮癌患者肿瘤组织中，miRNA-136表达下调。而在对替莫唑胺耐药的神经胶质瘤患者组织中，miRNA-136同样呈现低表达[18]。我们的研究中，对同步放化疗抗拒的中晚期宫颈癌患者血清miRNA-136呈低表达，这与上述文献报道一致。表明miRNA-136的表达下调与中晚期宫颈癌同步放化疗抗拒的产生有关。miRNA-136诱导患者对化疗抗拒的可能机制为：miRNA-136可以抑制肿瘤细胞凋亡，提高顺铂导致DNA损伤的修复能力[19]。

miRNA-206被认为与肌肉组织相关。miRNA-206在不同类型的恶性肿瘤中情况相同，在肺癌、子宫内膜癌、横纹肌肉瘤等肿瘤中均表达下调[20]，但miRNA-206在乳腺癌中的表达与雌激素受体的表达有关，在雌激素受体阴性的患者组织中，miRNA-206表达上调，而在雌激素受体阳性的患者组织中，miRNA-206的表达下调[15]。目前国内外有关miRNA-206的表达与恶性肿瘤放化疗敏感性关系的研究较少。本研究中，中晚期宫颈癌同步放化疗出现抗拒的患者组织中，miRNA-206表达上调。这提示miRNA-206的表达状况与中晚期宫颈癌同步放化疗敏感性密切相关。本研究为相关研究提供了一定的依据。但有关miRNA-206的表达导致中晚期宫颈癌同步放化疗抗拒的机制及相关信号通路仍然有待进一步深入研究。

本研究结果表明，miRNA作为与恶性肿瘤发病密切相关的生化指标，其表达水平与中晚期宫颈癌同步放化疗敏感性亦密切相关。因此临床上可以通过对相关miRNA进行靶向干预，进而提高中晚期宫颈癌患者对同步放化疗的敏感性，并提高治疗效果。中晚期宫颈癌患者血清中miRNA-136的表达下调、miRNA-206的表达上调可能与同步放化疗抗拒有关。

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（收稿日期：2017-08-14）endprint