高脂饮食对去卵巢大鼠骨微结构、骨IL—6及M—CSF mRNA水平的影响

薛英++++++王永炫

[摘要] 目的 觀察高脂饮食对绝经后雌性SD（sprague-dawiey）大鼠骨微结构、骨组织白介素-6（IL-6）及巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）mRNA的影响，探讨高脂对骨微结构的影响及其可能的发病机制。 方法 将40只6月龄雌性SD大鼠随机分为假手术+普通饲料饲养组（SHAM组）、假手术+高脂饲料饲养组（HFD组）、去卵巢+普通饲料组（OVX组）、去卵巢+高脂饲料饲养组（OVX+HFD组），每组10只。6个月后用微计算机断层扫描（Micro-CT）等方法检测大鼠右侧胫骨的骨微结构。用实时荧光定量聚合酶链反应（Realtime RT-PCR） 测量大鼠左侧股骨中IL-6和M-CSF mRNA的表达差异。 结果 6个月后，OVX 组的骨体积（BV/TV）、骨小梁数目（Tb.N）、骨小梁厚度（Tb.Th）低于SHAM组，骨小梁分离度（Tb.Sp）大于SHAM组（P<0.05）；OVX 组BV/TV、Tb.N均大于OVX+HFD组，Tb.Sp小于OVX+HFD组（P<0.05）；SHAM组 BV/TV、Tb.N、Tb.Th高于SHAM+HFD组， SHAM + HFD与OVX组相比，除Tb.N外，其BV/TV、Tb.Th及Tb.Sp均无明显差异（P>0.05）。OVX组M-CSF和IL-6 mRNA的表达均高于SHAM组（P<0.05）。SHAM的 M-CSF和IL-6 mRNA的表达低于SHAM+HFD组（P<0.05），SHAM+HFD的M-CSF和IL-6 mRNA的表达低于OVX组（P<0.05），但OVX组与OVX+HFD组比较，M-CSF和IL-6 mRNA的表达无显著差异（P>0.05）。 结论 高脂引起的骨微结构的改变有可能是通过提高IL-6、M-CSF mRNA水平，导致破骨细胞活性增强、骨吸收增加引起的。

[关键词] 高脂饮食；骨质疏松症；骨微结构；白介素-6；巨噬细胞集落刺激因子

[中图分类号] R392 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2017）31-0035-05

[Abstract] Objective To observe the effects of high-fat diet on bone microstructure， bone interleukin-6（IL-6）and macrophage colony-stimulating factor（M-CSF）mRNA in postmenopausal female SD rats（Sprague-dawiey）， and to explore the impact of high fat on bone microstructure and its potential pathogenesis. Methods A total of 40 female SD rats with 6 months old were randomly divided into sham operation+normal feed group（SHAM group）， sham operation+ high-fat feed group（HFD group）， ovariectomized+ normal feed group（OVX group）and ovariectomized+ high-fat feed group（OVX + HFD group）， with 10 rats in each group. After 6 months， microcomputer tomography（Micro-CT） and other methods were used to detect the bone microstructure of the right tibia. Realtime PT-PCR was used to measure the expression difference of IL-6 and M-CSF mRNA in the left femur of the rats. Results After 6 months， the bone volume（BV/TV）， the number of trabecular bone（Tb.N）and trabecular bone thickness（Tb.Th）in the OVX group were significantly lower than those in SHAM group， while the separation of trabecular bone（Tb.Sp）was higher than that in SHAM group（P<0.05）； BV/TV， Tb.N in OVX group were higher than those in OVX + HFD group， and Tb.Sp was lower than that in OVX + HFD（P<0.05）； BV/TV， Tb.N， Tb.Th in SHAM group were all higher than those in SHAM + HFD group. Compared with OVX group， other than Tb.N， BV/TV， Tb.Th and Tb.Sp in SHAM + HFD group were not significantly different（P>0.05）. The expression of M-CSF and IL-6 mRNA in OVX group was higher than that in SHAM group（P<0.05）. The expression of M-CSF and IL-6 mRNA in SHAM group was lower than that in SHAM + HFD group（P<0.05）. The expression of M-CSF and IL-6 mRNA in SHAM + HFD group was lower than that in OVX group（P<0.05）. However， there was no significant difference in the expression of M-CSF and IL-6 mRNA between OVX group and OVX + HFD group（P>0.05）. Conclusion Changes in bone microstructure induced by high fat may be caused by increased IL-6 and M-CSF mRNA levels， resulting in enhanced osteoclast activity and increased bone resorption.endprint

[Key words] High-fat diet；Osteoporosis；Bone microstructure；Interleukin-6（IL-6）； Macrophage colony-stimulating factor（M-CSF）

研究表明，高脂饮食可以导致肥胖、糖尿病、冠心病、动脉粥样硬化、胰岛素抵抗等一系列疾病，近年来越来越多的研究发现，高脂饮食随后引起的胆固醇（total cholesterol，TC）和低密度脂蛋白胆固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDLC）及甘油三酯（triglyceride，TG）水平的升高，高密度脂蛋白胆固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDLC）水平降低，与骨质疏松症密切相关，高脂引起骨质疏松的机制包括骨髓间充质干细胞向成骨分化减弱、成脂分化增强[1]；高脂血症时脂质氧化产物能促进活性氧簇（ROS）形成，导致氧化应激增强[2]，且与炎症因子的激活有关。高脂饮食能引起胰岛素抵抗、肝脏IL-6水平升高[3]，但其对骨组织IL-6和M-CSF的影响仍未见报道，是否通过增加IL-6，M-CSF的表达影响破骨活性亟待进一步验证，本文就高脂饮食喂养后骨微结构及骨组织IL-6、M-CSF mRNA表达做一探讨。

1材料与方法

1.1 实验动物与饲料

实验动物为福建医科大学提供的6月龄清洁级雌性SD（sprague-dawiey）大鼠，实验动物许可证号：SYXK（闽2016-0007），动物饲料购自福建医科大学，高脂饲料购自江苏协同生物，配方见表1。

1.2方法

6月龄清洁级雌性SD（sprague-dawiey）大鼠40只，体重（300±20）g，分笼饲养，室温（20±3）℃，相对湿度40%～60%，给予不同类型的饲料，自由饮水。将40 只SD大鼠随机分为假手术组（SHAM组，n=20）与去卵巢组（OVX组，n=20），用l0%水合氯醛0.3 mL/l00 g腹腔注射麻醉，后打开腹腔，OVX组摘除双侧卵巢，SHAM组仅切除卵巢附近与卵巢等大的脂肪组织。术后所有大鼠均予肌内注射青霉素5 万U/d，持续3 d，预防感染。

术后，去卵巢组进一步分为去卵巢后高脂饲料饲养组（OVX+HFD组）和去卵巢后普通饲料饲养组（OVX组），每组各10只。假手术组分为假手术后高脂饲料饲养组（SHAM+HFD组）和假手术后普通饲料饲养组（SHAM），每组10只。

1.3干预措施

高脂饲料喂养6个月后，拖颈处死，用微计算机断层扫描（micro-CT，型号：SCANCO VIVACT40）检测大鼠右侧胫骨骨微结构；用实时荧光定量聚合酶链反应法（Realtime RT-PCR）（TP800， 日本TaKaRa）检测大鼠左股骨M-CSF和IL-6 mRNA的表达。

1.4 检测指标

1.4.1 Micro-CT 各组右侧胫骨Micro-CT骨组织扫描：参数为：扫描分辨率：50 μm，旋转角度：360 度，旋转角度增：0.72 度，电压：70 kVP，功率：40 W，帧平均数：6，像素组合：1×1。BV/TV：相对骨体积，Tb.N：骨小梁数目，Tb.Sp：骨小梁分离度，Tb.Th.：骨小梁平均厚度。

1.4.2 Realtime PCR 各组大鼠左股骨， 采用Realtime RT-PCR（TP800，日本TaKaRa）检测左股骨组织。

表达引物设计、骨组织总RNA提取、聚合酶链反应及目的基因相对量的计算参照相关文献[4]。

1.5 统计学方法

采用SPSS 23.0統计学软件包进行统计分析，所得正态分布的计量资料以均数±标准差表示，采用LSD-t 检验，多组间计量单位比较采用方差分析及SNK法。两组计量资料变量间相关性比较采用线性相关分析。计数资料采用χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Micro-CT检测右侧胫骨的骨微结构

各组大鼠高脂饲养6个月后，予Micro-CT检测各组右侧胫骨的骨微结构（图1）及微结构参数（图2），OVX 组的BV/TV、Tb.N、Tb.Th低于SHAM组，Tb.Sp大于SHAM组，差异有统计学意义（P<0.05或P<0.001），表明造模成功。OVX 组与OVX+HFD组比较，其BV/TV、Tb.N均大于OVX+HFD组，Tb.Sp小于OVX+HFD组，差异有统计学意义（P<0.05或P<0.001），但其Tb.Th，两组比较差异无统计学意义（P>0.05）。SHAM组与SHAM+HFD组比较，其BV/TV、Tb.N、Tb.Th高于SHAM+HFD组（P<0.01），但Tb.Sp，两组比较差异无统计学意义（P>0.05）。SHAM + HFD组与OVX组比较，除Tb.N外，其BV/TV、Tb.Th及Tb.Sp均无明显差异（P>0.05）。见图2。

2.2 各组大鼠股骨M-CSF和IL-6 mRNA表达的影响

高脂饲养6个月后，检测左侧股骨M-CSF和IL-6 mRNA的表达情况。结果表明，OVX组与SHAM组比较，其M-CSF和IL-6 mRNA的表达均高于SHAM组，差异有统计学意义（P<0.001）。SHAM组与SHAM+HFD组比较，其M-CSF和IL-6 mRNA的表达低于SHAM+HFD组（P<0.001），SHAM+HFD组与OVX组，其M-CSF和IL-6 mRNA的表达低于OVX组（P<0.001），但OVX组与OVX+HFD组比较，M-CSF和IL-6 mRNA的表达无显著差异（P>0.05）。见图3、4。

3 讨论endprint

构成骨骼健康和力量的重要因素不仅包括骨矿物质密度，而且还包括骨微观结构的特征[5-6]。Micro-CT是一个常用于评估骨微观结构的有效测量方法，其提供了量化的结构信息，包括骨区、骨体积分数、骨小梁数量、骨小梁厚度及骨小梁分离度之间具体的参数，并且骨微观结构的三维重建[7]。

近几年在肥胖和骨骼健康的相关性中有许多报道。当伴随着肥胖、血胆固醇、中性脂肪和低密度脂蛋白胆固醇升高，出现骨密度及骨微结构改变，骨折风险增加[8]，在一项小鼠模型中，由于高脂饮食导致的肥胖，出现骨髓脂肪的增加，Micro-CT所检测的骨密度及骨微结构的改变，即使减重后，对已造成的骨丢失仍无法恢复，表明高脂对骨质量的改变是长期、持续性的损害[9]。研究表明，假手术组SD大鼠分别经高脂饲料及普通饲料饲养6个月后，高脂组骨小梁厚度和数目减少，骨小梁分离度增加，在三维结构中，高脂饲料饲养的大鼠，与普通饲料饲养的大鼠比较，骨小梁较为稀疏，厚度变薄，且小梁与小梁间的连接中断，这些微结构的变化导致骨小梁总数下降，骨质量下降。且去除卵巢后，高脂饮食能够进一步加重骨丢失（图3、4），与目前国内外的报道一致。

引起骨质疏松的主要原因在于骨微环境中成骨与破骨的失衡。高脂饮食后导致的机体脂代谢异常，继发骨质疏松，可能与以下因素有关：（1） 骨髓间充质干细胞向成脂分化增强，成骨分化减弱，其中包括骨形态发生蛋白-2（BMP-2）活性的抑制，而过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）活性的增强[9]；（2）与骨组织中脂质的持续聚集有关；（3）持续聚集的脂质会导致糖基化和氧化修饰，从而诱发炎症反应以及氧化应激的发生，炎症因子增加，如白介素-1（IL-1）、白介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）等 [10-12]。

IL-6是由T、B细胞和纤维母细胞、单核巨噬细胞以及成骨细胞激活后分泌而成。绝经后，雌激素水平的急剧下降，导致成骨表面的雌激素受体对IL-6的抑制下降，IL-6形成增加。高脂引起的IL-6升高的原因之一与胰岛素抵抗有关，合并代谢综合征患者（如肥胖、糖尿病等），体内一般存在较高水平的IL-6[13]。IL-6能够促进脂肪前体细胞向脂肪细胞转化，抑制成骨前体细胞向成骨细胞转化，成骨细胞形成减少，骨细胞合并骨胶原的能力下降，抑制骨形成。大鼠高脂喂养8周即可产生胰岛素抵抗[14]。而脂肪细胞生成增多导致的肥胖进一步促使炎症因子合成[15]。本课题中，去卵巢6个月后，随着IL-6的变化，其代表骨质量的Tb.N，Tb.Th，BV/TV等微结构参数下降，且予高脂喂养后，上述参数进一步下降，IL-6 mRNA表达仍有上升趋势，但无统计学意义。表明高脂喂养后，除IL-6外，可能还有其他的影响因素参与骨丢失。

在骨骼细胞形成分化的过程中，还有其他炎症因子的参与。破骨细胞的成熟与分化信号之一是通过成骨细胞提供的M-CS与表达于破骨细胞前体细胞表面的同源受体c-fms进行传递。M-CSF主要存在于骨髓腔中，它与RANKL同时作用于骨髓中破骨前体细胞的表达。本课题的前期实验中表明，绝经后可以导致M-CSF水平的升高[4]，但在高脂环境下，其与骨微结构的关系如何未见报道。本实验表明，绝经后，普通饲料饲养组随着骨质量下降，M-CSF mRNA的表达升高，但高脂饲养后，IL-6未有进一步变化。而SHAM组予高脂饲料饲养组，骨质量下降，且出现M-CSF的上升。M-CSF调节骨代谢的机制如何？绝经后，雌激素缺乏，可引起脂代谢及骨代谢的障碍。动脉粥样硬化泡沫细胞与破骨细胞有同源性，均来源于骨髓的单核巨噬细胞系统。雌激素缺乏引起胆固醇及低密度脂蛋白等升高，脂质斑块沉着，同时对破骨细胞的抑制减弱，破骨细胞活性增强。研究表明，动脉粥样硬化的脂质沉着处M-CSF水平表达增加[16]，当绝经后，雌激素水平的下降诱使IL-1和TNF等表达增加，增加后又可进一步引起“下游因子”IL-6，M-CSF的表达增加，破骨细胞活性增强，骨吸收增强。故M-CSF的增加可能为脂代谢异常和骨代谢异常的共同机制。

本实验目前较为粗浅地分析高脂饮食与骨微结构变化及炎症因子表达的相关性，仍有许多深层次的机制有待进一步的验证。

[参考文献]

[1] Kajarabille N，Diaz-Castro J，Hijano S，et al.A new insight to bone turnover：Role of ω-3 polyunsaturated fatty acids[J]. Scientific World Journal，2013， 2013： 589641.

[2] Teppner M，Boss F，Ernst B，et al. Application of lipid peroxidation products as biomarkers for flutamide-induced oxidative stress in vitro[J]. Toxicol Lett，2015，238（3）：53-59.

[3] 向靜，阿布力克木·吐尔地，王宁. 胰岛、肝细胞水平胰岛素抵抗与系统胰岛素抵抗关系的研究[J].新疆医科大学学报，2011，34（1）：1-4.

[4] 薛英，侯建明，林庆明，等.乳铁蛋白对去卵巢大鼠骨密度及骨M-CSF，IL-6 mRNA的影响[J]. 中华骨质疏松和骨矿盐疾病杂志，2013，5（2）：119-124.

[5] Kleerekoper M，Villanueva AR，Stanciu J，et al. The role of three-dimensional trabecular microstructure in the pathogenesis of vertebral compression fractures[J]. Calcif Tissue Int，1985， 37（6）：594-597.endprint

[6] Koyama A， Kumasaka S， Kashima I. Relationship between bone mineral density and 2D and 3D structure parameters of bone trabeculae[J]. Oral Radiol，2005，21：62-68.

[7] Hanson NA，Bagi CM.Alternative approach to assessment of bone quality using micro-computed tomography[J]. Bone，2004，35（1）：326-333.

[8] Park SJ，Ahn Y，Min HS，et al. Osteoporosis prevalence of radius and tibia and related factors using multiple bone sites quantitative ultrasound measurement of the Korean health and genome study cohort women[J]. Korean J Community Nutr，2005，10：536-545.

[9] Scheller EL，Basma K，Moller KL，et al. Changes in skeletal integrity and marrow adiposity during high-fat diet and after weight loss[J]. Frontiers in Endocrinology，2016，7（2）：102.

[10] Cao JJ. Effects of obesity on bone metabolism[J]. J Orthop Surg Res，2011，15（6）：30.

[11] Halade GV，Rahman MM，Williams PJ，et al .High fat diet-induced animal model of age-associated obesity and osteoporosis[J]. J Nutr Biochem，2010，21（12）：1162-1169.

[12] Hotamisligil GS. Inflammation and metabolic disorders[J]. Nature，2006，444（7121）：860-867.

[13] Ershler WB，Keller ET. Age-associated increased interleukin-6 gene expression，late-life diseases，and frailty[J]. Annu Rev Med，2000，51：245-270.

[14] 雷雨，唐暉，马光亮.IL-6与AMPK在运动抑制胰岛素抵抗发生中的作用研究[J].中国运动医学杂志，2014，3（8）：790-803.

[15] Ilich JZ，Kelly OJ，Kim Y，et al.Low-grade chronic inflammation perpetuated by modern diet as a promoter of obesity and osteoporosis[J].Arh Hig Rada Toksikol，2014， 65（2）：139-148.

[16] Qiao JH，Tripathi J，Mishra NK，et al. Role of macrophage colony-stimulating factor in atherosclerosis：Studies of osteopetrotic mice[J].American Journal of Pathology，1997，150（5）：1687.

（收稿日期：2017-08-21）endprint