破壁灵芝孢子粉对刀豆蛋白A诱导免疫损伤小鼠外周血CD4+和CD8+细胞因子水平的影响及护肝作用*

赵燕平 余亚平 胡 洁

浙江省中医院下沙院区 浙江 杭州 310018

破壁灵芝孢子粉对刀豆蛋白A诱导免疫损伤小鼠外周血CD4+和CD8+细胞因子水平的影响及护肝作用*

赵燕平 余亚平 胡 洁

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破壁灵芝孢子粉 刀豆蛋白A 免疫损伤 小鼠

细胞水平抗病毒是目前临床上治疗慢性乙型肝炎（以下简称“慢乙肝”）的最有效手段，但现有抗病毒药物只能抑制病毒而不能清除病毒[1]。目前的共识是，激活机体细胞免疫应答，特别是增强HBV特异性T淋巴细胞应答是打破HBV感染耐受、达到清除病毒的关键因素[2-3]，而中医药在慢乙肝免疫调控上具有独特的优势。破壁灵芝孢子粉是临床和民间常用的提高正气、增强免疫的珍贵中药，笔者采用ConA诱导免疫肝损伤小鼠模型，观察破壁灵芝孢子粉干预效果，探讨破壁灵芝孢子粉的护肝作用及其可能的免疫调节机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物：采用清洁级Balb/c雄性小鼠46只，体重20～30g，6～8周龄，购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司，生产许可证号[SCXK（沪）2013-2016]，饲养于浙江中医药大学动物实验研究中心屏障环境内，使用许可证号[SYXK（浙）2013-0184]，环境温度为23±1℃，相对湿度为50%～65%，饲喂全价营养颗粒饲料，自由饮水。

1.2 药物和试剂：破壁灵芝孢子粉：购自寿仙谷药业公司，使用时用生理盐水调配成两组浓度备用：低剂量组0.1g/ml、高剂量组0.2g/ml；刀豆蛋白A(ConA)购自Sigma公司（C2010，批号80M7680V），使用时溶于生理盐水；肝功能氨基转移酶试剂购自德国DiaSysDiagnoticsSystemsGmbH(批号分别为07235/00002244、07218/00001951)；抗CD4FITC，抗CD8FITC荧光单克隆抗体：购自BD公司（批号分别为557303、553035）。

1.3 方法：分述如下。

1.3.1 分组造模与给药：将46只Balb/c雄性小鼠正常饲养1周后随机分为4组：空白组10只；模型组12只；低剂量破壁灵芝孢子粉组（低灵组）12只；高剂量破壁灵芝孢子粉组（高灵组）12只。空白组正常饲养。造模参考刘光伟等[4]的方法，模型组及低灵组、高灵组均用ConA 5mg/kg尾iv，隔天1次，共2周。造模成功后，空白组及模型组予生理盐水0.1ml/10g ig，低灵组和高灵组分别用破逼灵芝孢子粉以1.0g/kg及2.0g/kg ig，共4周。

1.3.2 血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）检测：4周后摘眼球取血，检测ALT、AST水平，由浙江中医药大学动物实验中心协助完成。

1.3.3 外周血淋巴细胞亚群检测：摘眼球取血，加入抗凝管，PBS缓冲液稀释，加入淋巴细胞分离液，1800r/min，离心10min，吸取白色絮状淋巴细胞层，PBS缓冲液洗涤2次，弃上清，加抗体试剂，流式检测。

1.3.4 统计学方法：采用SPSS19.0软件进行统计处理，计量资料以±s表示，组间比较采用方差分析，P＜0.05有统计学意义。

2 结果

2.1 破壁灵芝孢子粉对小鼠血清ALT、AST水平的影响：实验过程中，由于灌胃操作失误，导致高灵组死亡2只，低灵组死亡1只。破壁灵芝孢子粉干预后，小鼠ALT、AST水平较模型组明显好转，高灵组较低灵组好转更明显，差异有统计学意义。提示破壁灵芝孢子粉可以改善ConA诱导的免疫性肝损伤。具体见表1。

表1 各组小鼠血清ALT、AST的比较（±s，U/L）

表1 各组小鼠血清ALT、AST的比较（±s，U/L）

注：与空白组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05；与低灵组比较，&P＜0.05。

AST 86.45±28.76 223.63±77.31*101.76±34.56#&134.38±42.67#组别空白组模型组高灵组低灵组只数10 12 10 11 ALT 67.45±23.46 201.78±62.47*92.76±33.78#&129.62±44.65#

2.2 破壁灵芝孢子粉对外周血淋巴细胞亚群的影响：与空白组比较，模型组小鼠CD4+%明显上升、CD8+%明显下降，药物干预后，小鼠CD4+%下降、CD8+%上升，且在一定范围内，药物浓度越高，效果越明显。具体见表2。

表2 各组外周血T细胞亚型的比较（±s）

表2 各组外周血T细胞亚型的比较（±s）

注：与空白组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05；与低灵组比较，&P＜0.05。

CD4+/CD8+3.29±1.78 21.5±12.5*2.99±0.7#&11.57±7.5#组别空白组模型组高灵组低灵组只数10 12 10 11 CD4+%10.5±2.6 29.6±3.1*19.2±2.4#&22.1±4.4#CD8+%3.8±1.5 1.6±0.5*6.6±1.3#&3.42±1.2#

3 讨论

慢乙肝的发病与机体的免疫功能紊乱密切相关，其中HBV特异性的CD4+和CD8+T细胞的低扩增和弱效应作用被确认为是其中最为关键的环节。CD4+T细胞因其具有辅助体液免疫和细胞免疫的功能被称为辅助性T细胞，CD8+T细胞主要为细胞毒性T细胞（CTL），可以识别并杀伤HBV感染的细胞，因此CD4+/CD8+比值的改变可以直接反应机体细胞免疫的功能状态。如果我们能通过药物等手段调整T淋巴细胞亚群的失衡，减弱其免疫抑制功能，提高表位特异性CTL的免疫效应，将为慢乙肝的治疗找到新的策略。

现有的免疫抑制剂如胸腺肽、治疗性乙肝疫苗因存在疗效不够理想、价格昂贵、注射不便等原因导致临床应用不多。近年来研究较多的Toll样受体激动剂、CTL调节剂、TCR转基因T细胞治疗等[5-6]尚局限在动物实验或小样本临床研究。中医药作为我国防治慢乙肝的重要措施，虽然在直接抑制病毒复制的近期疗效方面与干扰素、核苷类似物存在一定差距，但在整体免疫调控上却有着独特的优势，如猪苓多糖、香菇多糖、云芝多糖等药物成分可以提高巨噬细胞吞噬功能，促进T淋巴细胞E玫瑰花结形成和转化，激发机体产生多种与免疫和抗炎反应有关的生物活性因子，诱导干扰素产生[7]。因此研发出具有相关免疫调控作用的中药，使其与直接抑制病毒复制的西药联合应用，将病因治疗和病机治疗有机地结合起来，就有可能从根本上提高疗效。

灵芝，又称“仙草”，是一种珍贵的药用真菌，灵芝孢子是灵芝生长成熟期从菌盖弹射出来的淡雾状的极其微小的孢子，含有比灵芝子实体更加丰富的多糖类、三萜类、脂肪酸类、氨基酸等活性成分，具有增强免疫、抗肿瘤、抗炎、保肝、抗病毒等功能，且破壁后的灵芝孢子粉效果更好[8]。临床医生及民间百姓也会将灵芝制剂用于慢乙肝、红斑狼狼疮、萎缩性肌强直、恶性肿瘤等免疫功能低下患者疾病的治疗中[9]，但尚缺乏大样本、系统化的研究。

ConA是诱导免疫性肝损伤的经典试剂，其机制与T细胞和KC细胞相关，与人类慢性肝炎发病机制非常相似[10]，我们以ConA诱导小鼠肝损伤为模型，模拟慢乙肝的免疫失衡状态，观察破壁灵芝孢子粉干预后的血清ALT、AST水平外周血T淋巴细胞亚群的变化。研究发现破壁灵芝孢子粉可以有效降低小鼠血清肝酶水平，下调小鼠外周血的CD4+T淋巴细胞百分比、而CD8+T淋巴细胞百分比及CD4+/CD8+比值明显上升，说明破壁灵芝孢子粉可能通过调节T淋巴细胞亚群比例，减弱CD4+辅助性T细胞及相关效应细胞因子对机体的免疫抑制作用，促进CD8+T细胞增殖、增强CTL识别并灭杀感染细胞的作用，且随着药物剂量的增加，其护肝及免疫调节作用在一定范围内有所提高。笔者预测破壁灵芝孢子粉可以通过调节T细胞亚群比例、提高CTL活性来帮助机体产生有效抗病毒免疫应答，提高抗病毒疗效。今后我们也将更深入地研究破壁灵芝孢子粉的免疫调节机制及临床疗效，希望为实现慢乙肝的临床治愈提供更多安全有效的药物选择。

[1]程琦，施光峰.慢性乙型肝炎治疗进展及新策略[J].传染病信息，2016，29(2)：109-112.

[2]刘诗，汤善宏，钟晓祝，等.慢性乙型肝炎免疫治疗新策略[J].临床肝胆病杂志，2016，32(7)：1398-1402.

[3]原伟，严伟明，宁琴，等.慢性乙型肝炎临床免疫学研究进展[J].中国医师杂志，2017，19(1)：7-13.

[4]刘光伟，王灵台，高月求，等.刀豆蛋白A诱导的肝损伤模型T细胞亚群变化及机制探讨.中国中西医结合消化杂志[J].2008，16(5)：332-333.

[5]Qasim W ，Bmnetto M，Gehring AJ，et a1．Immunotherapy of HCC metastases with autologous T cell receptor redirected T cells，targeting HBsAg in a liver transplant patient[J]．J Hepatol，2015，62(2)：486-491.

[6]Gane EJ，Lim YS，Gordon SC． et a1． The oral tolllikereceptor-7agonistGS-9620inpatientswith chronichepatitisBvirusinfection[J].Hepatology，2015，63（2），320-328.

[7]高月求.中医药调控免疫是治疗慢性乙型肝炎优势环节[J].中西医结合肝病杂志，2010，20(3)：129-130.

[8]陈新滔，吴东，龚明，等.灵芝孢子粉咀嚼片对小鼠免疫功能的影响[J].江西中医药大学学报，2016，28(3)：73-75.

[9]沈华江，兰少波，周建康，等.灵芝汤联合阿德福韦酯治疗慢性乙型肝炎疗效观察及对免疫功能的影响[J].浙江中医杂志，2011，46(5)：320-321.

[10］KUNG J T.Impair ed clo nal expansion in athymic nudeCD4+/CD8+T-cells[J].J Immuno l，2001,140：3727-3735.

2017-08-17