基于CXCR4启动子的中药有效成分高通量筛选细胞模型构建和应用

2018-01-05 11:12王强利国海东王奕吴心语赵亮王莹
中国中医药信息杂志 2018年11期
关键词:单克隆细胞株荧光素酶

王强利 国海东 王奕 吴心语 赵亮 王莹

摘要:目的 以CXCR4基因启动子为靶点,建立促干细胞归巢药物筛选细胞模型,并对中药单体进行筛选。方法 将人CXCR4基因启动子序列(279 bp)插入荧光素酶报告基因载体pGL4.17-Basic中,构建重组质粒pGL4.17-CXCR4,与内参质粒pRL-TK共转染293细胞,经验证CXCR4启动子转录活性后,单细胞克隆培养以获得稳转细胞株,并用于候选中药单体1~10的筛选,最后应用Western blot验证所筛选出的中药单体促进间充质干细胞(MSCs)中CXCR4表达的作用。结果 成功建立药物筛选细胞模型,筛选出候选单体6提高CXCR4启动子活性的作用最强,Western blot结果证实候选单体6可明显促进MSCs中CXCR4的表达。结论 本研究建立的药物筛选细胞模型能实现对潜在促进干细胞归巢中药有效成分的高通量筛选。

关键词:心肌梗死;干细胞移植;CXCR4/SDF-1轴;荧光素酶报告基因;细胞模型

DOI:10.3969/j.issn.1005-5304.2018.11.012

中图分类号:R285.5 文献标识码:A 文章编号:1005-5304(2018)11-0052-05

Abstract: Objective To establish a cell model targeting the CXCR4 gene promoter to screen of drugs potentially promoting the stem cell homing, and to screen the monomers of traditional Chinese medicine. Methods The human CXCR4 gene promoter sequence (279 bp) was inserted into the luciferase reporter vector pGL4.17-Basic to construct the recombinant plasmid pGL4.17-CXCR4, which was co-transfected with the internal reference plasmid pRL-TK into 293 cells. After verifying transcriptional activity of CXCR4 promoter, single cell clones were cultured to obtain a stable transfectant cell line and used for screening of candidate Chinese herbal monomer (1 to 10). Finally, Western blot was used to verify the effect of the selected Chinese herbal monomer on the expression of CXCR4 in MSCs. Results The drug screening cell model was successfully established and the candidate monomer 6 was screened out because of the strongest effect on enhancing CXCR4 promoter activity. Western blot results verified that the candidate monomer 6 could promoted the expression of CXCR4 of MSCs. Conclusion The drug screening cell model established in this study was able to achieve high-throughput screening for potentially promoting the stem cell homing Chinese herbal monomer.

Keywords: myocardial infarction; stem cell transplantation; CXCR4/SDF-1 axis; luciferase reporter gene; cell model

心肌梗死(myocardial infarction,MI)后進行性心力衰竭是现代心脏病学的巨大挑战。通过移植自体或异体间充质干细胞(mesenchymal stem cell, MSCs)能增强心脏功能,缩小梗死面积,延缓心衰进程[1]。然而,移植后MSCs较低的心脏留存率严重影响了其治疗效果。研究显示,静脉注射后仅有2%的干细胞归巢至心脏,冠脉注射为15%,直接注射到心肌内仅有11%的留存率,大部分细胞分散在肺、肝和脾[2]。因此,促进移植后更多的干细胞向MI区归巢是增强MSCs治疗MI作用的关键。CXC趋化因子受体4[chemokine(C-X-C motif) receptor 4,CXCR4]和其配体基质细胞衍生因子-1α(stromal cell-derived factor-1α,SDF-1α)在MSCs归巢中发挥主要作用[3]。CXCR4是7次跨膜的G蛋白偶联受体,通过与SDF-1特异性结合介导MSCs迁移、增殖和分化[4]。研究发现,提高MSCs表达CXCR4水平能增强细胞迁移和向MI区域归巢的能力[5],使用CXCR4阻断剂AMD3100可明显抑制干细胞向MI区域归巢,使归巢的细胞数量显著减少[6]。因此,以CXCR4表达水平为考察对象,筛选能促进MSCs归巢中药单体,对于增强MSCs的治疗作用和阐明中药治疗心血管疾病的机制都具有十分重要的意义。据此,本研究构建了含CXCR4启动子的双荧光素酶报告系统的药物高通量筛选模型,并验证该细胞模型的可靠性。

1 实验材料

1.1 动物

雄性SD大鼠,体质量(200±20)g,上海中医药大学实验动物中心,动物许可证号SYXK(沪)2014-0008。饲养于上海中医药大学SPF级动物房,自由摄食饮水。

1.2 细胞株

293人胚肾上皮细胞为本实验室培养。

1.3 药物

人参皂苷Rb1和10种候选中药单体均购自上海融禾医药科技发展有限公司。

1.4 主要试剂与仪器

荧光素酶报告载体pGL4.17、海肾荧光素质粒pRL-TK,优宝生物;限制性内切酶Xhol、Hind Ⅲ和T4 DNA连接酶,东洋纺(上海)生物科技有限公司;SuperFectin Ⅱ脂质体转染试剂,上海普飞生物技术有限公司;感受态大肠杆菌DH5α、普通质粒小提试剂盒、胰蛋白胨、琼脂糖及酵母提取物,天根生化试剂有限公司;G418、转化生长因子-β1(TGF-β1),上海翊圣生物科技有限公司;双荧光素酶报告基因检测试剂盒,Promega公司;DMEM培养基、胎牛血清、青-链霉素、细胞培养瓶和培养板,Corning公司;兔抗人多克隆、抗体GAPDH、CXCR4和HRP标记羊抗兔二抗,Proteintech公司。酶标仪(Synergy 2,BioTek公司),荧光活体成像系统(Lumina XR,PerkinElmer公司),化学发光成像分析系统(Tanon 5200,天能)。

2 实验方法

2.1 CXCR4啟动子的合成

参考Wegner S A等[7]报道CXCR4启动子DNA,设计一对互补序列,标记为CXCR4-F/R,5'端引入酶切位点Xhol,3'端引入酶切位点Hind Ⅲ。委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成,DNA序列如下。CXCR4-F:5'-CTCGAGTACCGACCACCCGCAAAC AGCAGGGTCCCCTGGGCTTCCCAAGCCGCGCACCTCTCCGCCCCGCCCCTGCGCCCTCCTTCCTCGCGTCTGCCCCTCTCCCCCACCCCGCCTTCTCCCTCCCCGCCCCAGCGGCGCATGCGCCGCGCTCGGAG

CGTGTTTTTATAAAAGTCCGGCCGCGGCCAGAAACTTCAGTTTGTTGGCTGCGGCAGCAGGTAGCAAAGTGACGCCGAGGGCCTGAGTGCTCCAGTAGCCACCGCATCTGGAGAACCAGCGGTTACCAAGCTT-3';CXCR4-R:5'-AAGCTTGGTAACCGCTGGTTC TCCAGATGCGGTGGCTACTGGAGCACTCAGGCCCTCGGCGTCACTTTGCTACCTGCTGCCGCAGCCA ACAAACTGAAGTTTCTGGCCGCGGCCGGACTTTTATAAAAACACGCTCCGAGCGCGGCGCATGCGCCGCTGGGGCGGGGAGGGAGAAGGCGGGGTGGG

GGAGAGGGGCAGACGCGAGGAAGGAGGGCGCAGGGGCGGGGCGGAGAGGTGCGCGGCTTGGGAAGCCCAGGGGACCCTGCTGTTTGCGGGTGGTCG

GTACTCGAG-3'。

2.2 重组质粒构建

将合成的CXCR4启动子DNA和荧光素酶报告载体pGL4.17进行Xhol和Hind Ⅲ双酶切后,用T4 DNA连接酶16 ℃连接过夜,连接产物转化感受态大肠杆菌DH5α,筛选阳性克隆,双酶切鉴定后获得重组质粒pGL4.17-CXCR4P,送至生工生物工程(上海)股份有限公司基因测序鉴定。将质粒扩增后,用去内毒素质粒提取试剂盒提取无内毒素的重组质粒,备用。见图1。

2.3 质粒转染

含10%胎牛血清DMEM培养基37 ℃、5%CO2培养293细胞。将293细胞以5×105/mL密度接种于24孔板,待细胞生长至汇合80%,按SuperFectin Ⅱ脂质体转染试剂盒说明书,将重组质粒pGL4.17- CXCR4P(200 ng/孔)和内参质粒pRL-TK(60 ng/孔)共转染至293细胞。同时,将质粒pGL4.17和pRL-TK共转染作为阴性对照组。

2.4 启动子活性评价

质粒转染24 h后更换细胞培养基,加入TGF-β1(2 ng/mL)诱导细胞24 h,按照双荧光素酶报告基因检测试剂盒说明书检测各孔荧光强度:PBS清洗细胞2次,各孔加入100 μL细胞裂解液,室温振摇裂解20 min彻底裂解细胞。取20 μL细胞裂解液上清,加入100 μL荧光素酶检测试剂Ⅱ,酶标仪设置为检测化学发光,检测方式为延迟2 s后读取10 s内荧光值,再加入海肾荧光素酶检测试剂(Stop and Glo?),猝灭荧光后检测海肾荧光素酶活性。荧光素酶活性=每组萤火虫荧光素酶活性/海肾荧光素酶活性。将所测数值与阴性对照组荧光素酶活性值相比,转染pGL4.17-CXCR4P组荧光素酶活性值为比较后的相对值。

2.5 建立稳定转染pGL4.17-CXCR4P单克隆细胞株

将293细胞种植于6孔板,达到汇合90%时进行细胞转染,24 h后换液,加入终浓度为1 mg/mL的G418继续培养,持续处理10 d后,PBS清洗死亡细胞,胰酶消化贴壁细胞,收集细胞后吹打成单细胞悬液,细胞以1个/孔密度种植于96孔板。待细胞克隆形成后,将各个克隆的细胞以相同密度接种于96孔板,24 h后,加入D-luciferin至终质量浓度60 μg/mL, 荧光活体成像系统拍摄,选择信号最强的单克隆扩大培养,并命名为293-CXCR4单克隆细胞。

2.6 药物筛选

293-CXCR4单克隆细胞以1×104/mL铺于96孔板,待细胞汇合度约90%~95%后无血清培养,加入候选中药单体(8 μg/mL),参考Lan T H等[8]报道,将人参皂苷Rb1作为阳性对照药物,不加入任何药物作为阴性对照组。作用24 h 后,用双荧光素酶报告基因检测系统检测荧光素酶活性值。将所测得数值与阴性对照组的荧光素酶活性值相比,阳性对照组和候选药物组荧光素酶活性值为比较后的相对值。

2.7 异体间充质干细胞分离培养

应用差速贴壁法分离骨髓中MSCs。将SD大鼠拉颈处死,用75%乙醇浸泡消毒8 min,分离双侧股骨和胫骨。剔除骨组织周围组织后,暴露骨髓腔,用10 mL注射器抽取PBS冲洗骨髓腔,将带有骨髓细胞的PBS收集于10 mL离心管,1000 r/min离心10 min。弃上清液,用含10%胎牛血清、1%青-链霉素的DMEM培养液重悬细胞,以5×105个/mL密度均匀接种于25 cm2培养瓶中,置37 ℃、5%CO2细胞培养箱中培养。第3日更换培养液后继续培养。当细胞汇合70%~80%时传代。取3~5代MSCs进行后续实验。

2.8 Western blot检测

將MSCs接种于6孔板,24 h后加入筛选出的中药单体,处理24 h后收集MSCs,PBS清洗2遍,加RIPA裂解液,4 ℃裂解30 min后,4 ℃、12 000 r/min离心15 min,收集上清液,按Bradford法测定蛋白含量。加入5×loading buffer,于100 ℃变性5 min。将样品加入10%SDS-PAGE胶样品槽中,150 mV电泳50 min后,100 mV 转膜1 h至硝酸纤维素膜。一抗4 ℃孵育过夜。TBST反复洗膜后,HRP标记二抗孵育1 h,洗膜后化学发光试剂显色,用凝胶成像系统拍摄图片。

3 统计学方法

采用Graphpad5.0统计软件进行分析。计量资料以x±s表示,组间比较采用LSD-t检验。P<0.05表示差异有统计学意义。

4 结果

4.1 构建重组质粒

琼脂糖凝胶电泳成像显示,Xhol和HindⅢ双酶切产物在291 bp和5567 bp处有特异性条带(见图2),与理论值相一致。重组质粒经生工生物工程(上海)股份有限公司基因测序鉴定后与CXCR4基因序列完全一致。以上结果表明成功构建pGL4.17-CXCR4P重组质粒。

4.2 检测CXCR4启动子活性

TGF-β1诱导24 h后,转染pGL4.17-CXCR4P的荧光素酶活性相对值为19.7±0.32,见图3。表明TGF-β1能增强CXCR4启动子活性,提示该细胞模型可用于筛选增强CXCR4表达的中药单体。

4.3 建立稳定转染细胞株

为了保证双荧光素酶反应灵敏,筛选结果均一,将转染pGL4.17-CXCR4P的293细胞进行单克隆培养,筛选出稳定转染的细胞株,即293-CXCR4单克隆细胞株。活体成像荧光系统筛选结果显示,3号单克隆细胞株光通量最强(见图4),将其扩增后液氮冻存备用。

4.4 筛选中药单体

双荧光素酶报告基因检测系统检测结果显示:与阴性对照组比较,候选单体2、5、6、10组荧光素酶活性相对值明显升高,候选单体3组CXCR4荧光素酶活性相对值明显降低;候选单体6组荧光素酶活性相对值高于阳性对照组。以上结果说明,候选单体2、5、6、10能增强CXCR4启动子活性,其中候选单体6作用最强,见图5。

4.5 促进CXCR4表达初步验证

为验证本细胞模型的可靠性,本研究采用Western blot验证筛选出的单体6促进MSCs表达CXCR4的作用。结果显示,候选单体6能明显增强MSCs中CXCR4表达,且具有剂量依赖性,见图6。此结果证明该细胞筛选模型成功筛选出具有促进干细胞CXCR4表达作用的中药单体。

5 讨论

CXCR4/SDF-1轴在干细胞归巢中发挥重要作用。CXCR4表达于多种干细胞膜,能与SDF-1特异性结合,介导干细胞向SDF-1表达区域迁移和黏附[4]。急性MI后,缺血部位的心肌组织分泌SDF-1,募集干细胞归巢以修复受损组织。用体外培养的MSCs移植治疗MI是干细胞研究的热点,然而随着传代次数的增多,MSCs中CXCR4的表达水平显著降低[9],削弱其向受损心肌迁移的能力,严重降低了干细胞移植的治疗效果,而通过基因修饰[10]等手段使MSCs过表达CXCR4则能明显促进其向SDF-1分布区域的迁移。因此,以CXCR4为靶点,筛选出具有上调干细胞CXCR4表达水平的中药单体,可能具有促进移植后干细胞归巢的作用。

本研究将CXCR4启动子基因片段和带有荧光素酶基因的报告载体重组得到重组质粒,转染293细胞后,通过检测荧光素酶的表达反映CXCR4启动子的活性强弱。在此基础上,通过单克隆培养,建立稳定表达CXCR4启动子的单克隆细胞株,利用荧光素酶报告基因检测系统筛选中药单体。最后采用Western blot技术,初步证明筛选出的中药单体对体外培养MSCs的CXCR4表达有显著促进作用,验证了该细胞筛选模型的可靠性。与传统的筛选方法相比,应用细胞模型筛选中药单体,更接近体内真实的生理环境,结果可靠性较高;同时,利用单克隆细胞株筛选具有结果均一性好、可重复性高等优点;此外,利用双荧光素酶报告基因,检测CXCR4启动子的活性,操作简单,灵敏度高,实验周期短,非常适用于中药单体的高通量筛选。

CXCR4不仅介导干细胞归巢,在恶性肿瘤转移和艾滋病病毒感染T细胞的过程中均发挥重要作用[11]。因此,本研究建立的细胞筛选平台不仅可用于干细胞治疗MI中药单体的筛选,也可用于抗肿瘤和抗艾滋病中药单体的筛选,为传统中药的现代研究提供方法学参考。

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