基于含量分析探讨黄芪—葛根药对不同配比的差异

佟智斌 谭红 尹聪 邱路雅 袁丽君 涂星

摘要：目的 探究不同配比的黃芪-葛根药对水煎液中葛根素的含量，验证经方黄芪葛根汤和玉液汤配伍比例的合理性，为临床用药提供参考。方法 设置不同剂量配比的黄芪-葛根药对（0∶1、1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、1∶2、1∶3、1∶4），以SinoChrom ODS-BP（4.6 mm×250 mm，5 μm）为色谱柱，甲醇-0.1%磷酸（35∶65）为流动相，流速为0.5 mL/min，检测波长250 nm，进样量20 μL，测定不同配比药对水煎液中葛根素含量。结果 葛根素在5～300 μg/mL浓度范围内呈良好的线性关系，回归方程为Y=66 449.269 1X-175 665.663 1（r=0.999 6），重复性、稳定性和回收率良好。黄芪与葛根的比例为0∶1、1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、1∶2、1∶3、1∶4的混煎液中葛根素含量分别为（2.506 7±0.025 8）%、（2.526 7±0.071 2）%、（2.863 3±0.086 4）%、（2.956 7±0.119 6）%、（2.835 0±0.078 7）%、（2.480 0±0.072 4）%、（2.530 0±0.064 8）%、（2.183 3±0.128 9）%。结论 黄芪-葛根药对配伍比例为2∶1、3∶1、4∶1时，水煎液中葛根素含量最高，证实经方中两者的配比合理，可作为临床选用的最优配比。

关键词：黄芪-葛根药对；配伍比例；葛根素；含量分析；高效液相色谱法

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.11.016

中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2018）11-0073-04

Abstract： Objective To study the contents of puerarin in decoction with different compatibility ratios of Astragali Radix and Puerariae Lobatae Radix； To verify the rationality of compatibility ratios of Huangqi Gegen Decoction and Yuye Decoction； To provide references for clinical medication. Methods Different compatibility ratios of Astragali Radix and Puerariae Lobatae Radix were set as 0：1， 1：1， 2：1， 3：1， 4：1， 1：2， 1：3， and 1：4. SinoChrom ODS-BP （4.6 mm × 250 mm， 5 μm） was used as the chromatographic column to detect the contents of puerarin； methanol-0.1% phosphoric acid （35：65） was used as the mobile phase with 0.5 mL/min flow rate； sample volume was 20 μL； the wavelength was 250 nm. Results The regression equation of puerarin was Y=66 449.269 1X-175 665.663 1 （r=0.999 6） in the range of 5 to 300 μg/mL， showing a good linear relationship. The repeatability， stability and recovery rate were fine as well. The contents of puerarin were （2.506 7±0.025 8）%， （2.526 7±0.071 2）%， （2.863 3± 0.086 4）%， （2.956 7±0.119 6）%， （2.835 0±0.078 7）%， （2.480 0±0.072 4）%， （2.530 0±0.064 8）%， and （2.183 3±0.128 9）% in different compatibility ratios of Astragali Radix and Puerariae Lobatae Radix with 0：1， 1：1， 2：1， 3：1， 4：1， 1：2， 1：3， and 1：4， respectively. Conclusion When the compatibility ratios of Astragali Radix and Puerariae Lobatae Radix are 2：1. 3：1， and 4：1， the contents of puerarin in decoction are the highest. This study verifies that the compatibility ratios of Astragali Radix and Puerariae Lobatae Radix in classical prescriptions are rational， which can be the optimal compatibility ratios in clinic.

Keywords： Astragali Radix and Puerariae Lobatae Radix； compatibility ratios； puerarin； content analysis； HPLC

黄芪-葛根为临床常用对药，用于治疗气阴两虚之高血压、糖尿病和中风后遗症等[1]，尤其适用于糖尿病合并高血压、冠心病和脑血管病变的患者[2]。王春怡等[3]研究发现，黄芪葛根汤通过降低糖尿病小鼠的空腹血糖，提高糖耐量，增加小鼠对胰岛素的敏感指数和降低胰岛素抵抗指数，同时下调血脂和血清中游离脂肪酸的水平，发挥治疗糖尿病及胰岛素抵抗作用。现代研究表明，黄芪-葛根药对对肝脏糖脂代谢、胃黏膜损伤、糖尿病肾病、糖尿病心肌病、神经根型颈椎病等都具有较好的治疗或保护作用[4-8]。

《证治汇补》黄芪葛根汤以黄芪一两、葛根五钱组成，张锡纯《医学衷中参西录》中的玉液汤用黄芪五钱、葛根一钱半以治疗消渴。本研究以黄芪、葛根为关键词，在线检索中国中医药数据库（中药类、方剂类、药品类，http：//cintmed.cintcm.com/cintmed）、中成药处方数据库（https：//db.yaozh.com/chufang）、中国药典数据库（2015年版，http：//www.drugfuture. com/standard/）、CNKI专利数据库（http：//kns.cnki.net/ kns/brief/result.aspx？dbprefix=SCDB），并手工检索2015年版《中华人民共和国药典》，发现含有葛根-黄芪药对的常用药品有60余种，其中黄芪-葛根的配比包括1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、1∶2、1∶3、1∶4等，不同配比对葛根主要有效成分葛根素的含量是否存在影响尚未见报道。本研究采用RP-HPLC研究黄芪-葛根药对以1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、1∶2、1∶3、1∶4的不同比例配伍时葛根素含量的变化，验证经方黄芪葛根汤和玉液汤配比的合理性，为临床用药提供参考。

1 仪器与试药

高效液相色谱仪系统（日本岛津），包括SPD- 10Avp/AVvp紫外-可见分光光度检测器、LC-10ATVP二元梯度泵；N2000双通道色谱工作站（赛智科技杭州有限公司）；BT-25S型十万分之一电子分析天平（塞多利斯科学仪器北京有限公司）；Mili-Q超纯水机（贝徕美生物科技有限公司）；KQ2200E型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；BUCHI R-210旋转蒸发仪（SWITZERLAND）；TD5A-WS台式低速离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）；SHZ-D（Ⅲ）循环水式多用真空泵（河南省予华仪器有限公司）；YB-2000A型高速多功能粉碎机（浙江永康市速锋工贸有限公司）。

葛根素对照品（批号110752-201615），中国食品药品检定研究院；甲醇为色谱纯；水为去离子超纯水；磷酸为分析纯。葛根、黄芪饮片，购于恩施宏升大药房，经湖北民族学院医学院朱敏英教授鉴定，分别为豆科植物甘葛藤Pueraria thomsonii Benth.的根和豆科植物膜荚黄芪Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge.的根。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

SinoChrom ODS-BP色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相为甲醇-0.1%磷酸（35∶65），流速为0.5 mL/min，检测波长为250 nm，柱温为室温，进样量为20 μL。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备

精密称取置于P2O5中干燥至恒重的葛根素对照品10 mg，加30%甲醇溶解并定容至10 mL，即得1 mg/mL对照品贮备液，置于5 ℃冰箱，备用。

2.2.2 供试品溶液的制备

取黄芪、葛根饮片，用粉碎机粉碎，过10目筛。按葛根（固定为6 g）与黄芪不同配比（1∶0、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、2∶1、3∶1、4∶1）分别称量粗粉，加10倍量水煎煮2次，第1次1.5 h，第2次0.5 h，合并水煎液，旋转蒸发（58 ℃，300 r/min）浓缩，冷却后加超纯水溶解并定容至50 mL，取10 mL过0.45 μm微孔滤膜，即得。

2.2.3 阴性对照溶液的制备

取黄芪饮片，按供试品溶液制备方法制备水煎液，即得。

2.3 方法学考察

2.3.1 系统适用性试验

取“2.2”项下对照品溶液、葛根单煎液、黄芪-葛根1∶1水煎液和阴性对照溶液，按“2.1”项下色谱条件进样，色谱图见图1。在该色谱条件下，葛根素素的保留时间约为19.1 min，分离度R>1.5，理论塔板数不低于4000，表明样品中的葛根素分离度良好，阴性对照及其他成分无干扰。

2.3.2 线性关系考察

精密吸取“2.2.1”项下葛根素对照品贮备液50、100、200、400、600、1000、2000、3000 μL于10 mL容量瓶中，加30%乙醇定容刻度，即得系列濃度的对照品溶液。按“2.1”项下色谱条件进样测定，以对照品浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程Y=66 449.269 1X-175 665.663 1（r=0.999 6），表明葛根素在5～300 μg/mL范围内线性关系良好。

2.3.3 精密度试验

取“2.3.2”项下5、20、100 μg/mL葛根素对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件重复进样6次，每次20 μL，计算峰面积RSD。结果RSD分别为0.671%、0.293%、1.414%，表明仪器精密度良好。

2.3.4 稳定性试验

取黄芪-葛根1∶1配比的供试品溶液，室温放置，分别于0、2、4、6、8、10、12、18、24 h进样3次，测定峰面积。结果葛根素峰面积RSD=2.612%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.3.5 加样回收率试验

精密称取3份0.1 g已知葛根素含量为2.51%的葛根粗粉，分别加入葛根素对照品（相当于粗粉中葛根素含量的80%、100%、120%），加10倍量水煎煮2次，第1次1.5 h，第2次0.5 h，合并水煎液，按“2.1”項下色谱条件进样，计算平均回收率。结果平均加样回收率分别为101.14%、98.94%、99.64%，RSD分别为1.65%、0.69%、2.45%，见表1。

2.4 样品含量测定

按“2.2”项下方法，按黄芪-葛根（固定为6 g）不同配比（0∶1、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、2∶1、3∶1、4∶1）平行制备6份供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样，测定葛根素含量。若测得葛根素峰面积不在标准曲线范围内，则倍比稀释至符合标准曲线范围。结果见表2。

可见，黄芪-葛根（固定为6 g）不同配比水煎液中葛根素含量存在显著差异，与葛根单煎（0∶1组）比较，1∶1、1∶2、1∶3组葛根素含量差异无统计学意义（P>0.05），1∶4组葛根素含量显著降低（P<0.05），而2∶1、3∶1、4∶1组葛根素含量显著升高（P<0.05），3组比较差异无统计学意义（P>0.05）。

3 讨论

2015年版《中华人民共和国药典》测定葛根中葛根素含量采用30%甲醇超声提取制备样品，以甲醇-水（25∶75）作为流动相[9]。本研究以该色谱条件进行预试验，发现葛根素的分离效果欠佳，可能与本研究以水作为提取溶剂导致葛根素水解有关。葛根素及其水解产物均可能为多羟基化合物，流动相pH值对其分离度的影响较大，故本研究调整流动相pH值，以甲醇-0.1%磷酸水溶液（35∶65）为流动相进行洗脱，保留时间约为19 min，极大缩短了分析时间。

古代医家常用黄芪、葛根治疗消渴。《日华子本草》言黄芪能“助气，壮筋骨，长肉，补血，破癥癖，瘰疬瘿赘，肠风，血崩带下，赤白痢，产前后一切病，月候不匀，消渴，痰嗽，并治头风热毒，赤目”等；《普济方》记载黄芪治疗消渴的方剂有115首。葛根治疗消渴始载于《神农本草经》，指出葛根“主治消渴，身大热，呕吐，诸痹，起阴气，解诸毒”。两者配伍组成的黄芪葛根汤和玉液汤中黄芪、葛根的比例分别为2∶1和3∶1。王治平[10]开展的黄芪-葛根药对配伍规律对药效物质的影响研究发现，葛根素为君有效成分，3-羟基葛根素、大豆苷和毛蕊异黄酮葡萄糖苷为臣有效成分，黄芪-葛根药对化学层次配伍存在协同作用，主要表现为以2∶1配伍时葛根素、大豆苷、黄芪甲苷等溶出量显著增加。葛根素具有降血糖、降血脂、改善胰岛素抵抗、抗氧化应激、减轻炎性反应等作用[11]。故本研究以葛根素为指标成分检测其在葛根-黄芪不同配比水煎液中的含量。

本研究发现，当黄芪-葛根以2∶1、3∶1、4∶1比例配伍时，其水煎液中葛根素的含量较其他配比高，且三者间无显著差异，从葛根素含量角度验证了黄芪葛根汤和玉液汤配比是合理的。王治平[10]研究发现，黄芪-葛根混煎时各成分溶出量均比单煎时高，而本研究发现黄芪-葛根混煎时，黄芪比例高则葛根素的溶出量较大，葛根比例高则葛根素的溶出量无明显变化甚至降低，其原因可能在于该研究中供试品溶液制备是以乙醇回流提取，而本研究是以水煎煮，导致指标成分溶出量不同。

不同配比的黄芪-葛根药对在糖尿病患者或动物模型中的生物药剂学与药代动力学特征如何，体内药动学的变化是否能引起作用效果的改变，还有待进一步深入研究。

参考文献：

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[2] 王庆国.糖尿病及其并发症常用药对[M].北京：中国医药科技出版社， 2006：93-96.

[3] 王春怡，陈艳芬，李卫民，等.黄芪葛根汤对实验性糖尿病及胰岛素抵抗的影响[J].中国实验方剂学杂志，2011，17（16）：144-149.

[4] 李艳敏，范颖，刘烨，等.黄芪黄酮与葛根黄酮配伍对肝脏糖脂代谢的影响[J].中国实验方剂学杂志，2015，21（10）：109-112.

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[6] 聂彦娜.黄芪和葛根素注射液对糖尿病肾病内质网应激GRP78、ATF4、CHOP表达的影响[D].北京：北京中医药大学，2014.

[7] 易月娥.黄芪和葛根对糖尿病肾病内质网激未折叠蛋白反应PERK通路的影响[D].北京：北京中医药大学，2014.

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[10] 王治平.探讨“黄芪-葛根”药对配伍规律对药效物质的影响[D].广州：广州中医药大学，2011.

[11] 罗春，步世忠，王福艳.葛根素治疗2型糖尿病的药理机制和临床进展[J].基础医学与临床，2016，36（11）：1582-1585.