当归中混入不同比例独活HPLC特征指纹图谱研究

张平 马潇 王晓琳 李冬华 宋平顺

摘要：目的 建立测定当归中按不同比例掺入独活的HPLC分析方法及特征指纹图谱，为HPLC特征指纹图谱法甄别当归药材掺伪样品提供依据。方法 采用Agilent TC-C18色谱柱（5 μm，4.6 mm×250 mm），以乙腈（A）-0.05%磷酸（B）为流动相，梯度洗脱（0～20 min，95%～75%B；20～60 min，75%～65%B；60～80 min，65%～5%B），流速1 mL/min，检測波长254 nm，柱温30 ℃。采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》对当归、独活及掺伪样品的HPLC图谱进行比较分析。结果 当归和独活色谱图中各色谱峰分离良好，HPLC指纹图谱中有11个峰可作为区别点，其中7号峰为阿魏酸，32号峰为蛇床子素，34号峰为二氢欧芹醇当归酸酯。结论 本方法快速、简单易行，能够全面反映当归药材品质，可以明确判断当归中是否混入独活。

关键词：当归；独活；高效液相色谱法；指纹图谱；掺伪

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.11.018

中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2018）11-0083-04

Abstract： Objective To establish HPLC analysis methods and fingerprint of different proportions of Angelicae Pubescentis Radix in Angelicae Sinensis Radix； To use HPLC fingerprint method to identify the adulteration of Angelicae Pubescentis Radix in Angelicae Sinensis Radix. Methods Agilent TC-C18 column （5 μm， 4.6 mm × 250 mm） was adopted. Acetonitrile （A） - 0.05% phosphoric acid （B） was the mobile phase， and the gradient elution （0–20 min， 95%–75%B； 20–60 min， 75%–65%B； 60–80 min， 65%–5%B） was used； The flowrate was 1 mL/min； Detection wavelength was 254 nm； Column temperature was 30 ℃. The HPLC spectra of Angelicae Sinensis Radix， Angelicae Pubescentis Radix and adulterated samples were compared and analyzed by using TCM chromatogram fingerprint similarity evaluation system. Results Angelicae Sinensis Radix and Angelicae Pubescentis Radix showed good chromatographic peaks in chromatogram separation. 11 peaks in HPLC fingerprint could be used as the mark， including 7th peak for ferulic acid， 32th peak for osthole， and 34th peak for columbianadin. Conclusion This method is rapid， simple and feasible， can fully reflect the quality of Angelicae Sinensis Radix and clearly identify whether Angelicae Pubescentis Radix is adulterated in Angelicae Sinensis Radix.

Keywords： Angelicae Sinensis Radix； Angelicae Pubescentis Radix； HPLC； fingerprint； adulteration

独活为伞形科植物重齿毛当归Angelica pubescens Maxim.F.biserrata Shan et Yuan的干燥根，具有祛风除湿、通痹止痛功效[1]。当归为伞形科植物当归Angelica sinensis（Oliv.）Diels的干燥根，具有补血活血、调经止痛、润肠通便功效[1]。独活主要含有蛇床子素、二氢欧山芹素、二氢欧山芹醇、欧前胡素、异欧前胡素等成分，当归主要含挥发油（藁本内酯）、有机酸（阿魏酸、亚油酸、硬脂酸）、多糖和黄酮等[2-5]。

当归和独活药材来源相近、外观性状差异不大[6]，药材商品流通和临床用药时极易混淆。甄别药材市场上掺伪现象，传统的性状鉴别存在很大困难，中药指纹图谱技术则以其特征性和完整性而具有明显优势[7]，因此，建立当归和独活药材指纹图谱对甄别药材真伪具有重要意义[8-10]。本研究通过HPLC-DAD建立当归、独活及当归中按不同比例掺入独活的指纹图谱，从而对当归与独活进行鉴别，在药品检验及临床应用中对掺假样品进行甄别，保证用药安全。

1 仪器与试药

Waters e2998高效液相色谱仪（2998 DAD检测器，Empower3工作站），美国Waters公司；ME-204型分析天平，梅特勒公司；XMTD-4000恒温水浴锅，北京永光明仪器有限公司。

蛇床子素对照品（批号110822-201308）、二氢欧山芹醇当归酸酯对照品（批号111583-200402）、阿魏酸对照品（批号110773-201313）、欧前胡素对照品（批号110826-201616），中国食品药品检定研究院；当归、独活样品各5批，均由本课题组在甘肃、四川、湖北等地采集或购买，经甘肃省药品检验研究院宋平顺主任药师鉴定，分别为伞形科植物当归Angelica sinensis（Oliv.）Diels的干燥根、伞形科植物重齿毛当归Angelica pubesce Maxim.f.biserrata Shan et Yuan的干燥根。乙腈为色谱纯（天津市康科德科技有限公司），水为自制纯化水，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 掺伪样品的制备

取当归、独活样品，粉碎，置自封袋中备用。取当归样品粉末10 g，共5份，分别置烧杯中，放入分析天平称量，分别精密加入0.5、1、2、3、4 g独活样品粉末，混匀，制成分别含5%、10%、20%、30%、40%独活的掺伪当归样品，备用。

2.2 溶液的制备

2.2.1 供试品溶液

精密称取样品1.0 g，置具塞锥形瓶中，精密加入20 mL甲醇，密塞，称定质量，加热回流30 min，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，静置，取上清液，过滤，取续滤液，即得。

2.2.2 对照品溶液

精密称取蛇床子素、欧前胡素、阿魏酸、二氢欧山芹醇当归酸酯对照品适量，加甲醇制成每1 mL含蛇床子素、欧前胡素、阿魏酸、二氢欧山芹醇当归酸酯80 μg的混合溶液，即得。

2.3 色谱条件

采用Agilent TC-C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为乙腈（A）-0.05%磷酸（B）[4-5，11-12]，梯度洗脱（见表2），流速1 mL/min，检测波长254 nm，柱温30 ℃，进样量20 μL。

2.4 方法学考察

2.4.1 系统适用性及专属性试验

取对照品溶液、供试品溶液，按“2.3”项下色谱条件进样，结果表明各色谱峰分离度较好，峰形对称，专属性强。

2.4.2 精密度试验

精密吸取当归供试品溶液，连续进样5次，以7号峰阿魏酸为内参比峰，测得各共有峰的相对保留时间RSD为0.1%～0.5%，相对峰面积RSD为1.5%～3.0%。精密吸取独活供试品溶液，連续进样5次，以32号峰蛇床子素为内参比峰，测得各共有峰的相对保留时间RSD为0.3%～1.0%，相对峰面积RSD为2.0%～3.5%，表明仪器精密度良好，符合指纹图谱测定要求。

2.4.3 稳定性试验

取当归供试品溶液，于制备后0、4、8、16、24 h进样分析，测得各共有峰的相对保留时间RSD为0.2%～1.5%，相对峰面积RSD为1.1%～2.8%。取独活供试品溶液，于制备后0、4、8、16、24 h进样分析，测得各共有峰的相对保留时间RSD为0.5%～2.0%，相对峰面积RSD为1.6%～3.2%。表明供试液在24 h内稳定。

2.4.4 重复性试验

精密称取当归样品5份，按“2.2.1”项下方法平行制备供试品溶液，分别进样并记录。测得各共有峰的相对保留时间RSD为0.1%～0.4%，相对峰面积的RSD为0.7%～2.8%。符合指纹图谱要求。

2.5 指纹图谱分析

2.5.1 指纹图谱的建立与主要色谱峰的确认

按“2.3”项下色谱条件分别对当归及独活供试品溶液进行测定，采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）》软件，分别对当归和独活进行色谱峰匹配，生成指纹图谱（见图1、图2），并计算各批次样品指纹图谱与各自生成的对照图谱的相似度，结果当归和独活的指纹图谱相似度均在0.9以上。

在同样色谱条件下测定蛇床子素、欧前胡素、阿魏酸、二氢欧山芹醇当归酸酯对照品，并与当归、独活样品指纹图谱中相应色谱峰进行比较，结果表明，当归指纹图谱中7号峰的保留时间及紫外光谱与阿魏酸吻合，7号特征峰为阿魏酸。独活指纹图谱中32、34号峰的保留时间及紫外光谱与蛇床子素、二氢欧山芹醇当归酸酯吻合，32、34号特征峰分别为蛇床子素、二氢欧山芹醇当归酸酯。对照品图谱见图3。

2.5.2 当归、独活及掺伪样品指纹图谱比较

同一色谱条件下的当归、独活HPLC指纹图谱见图4、图5，其中当归共有峰26个，独活共有峰34个。通过对当归、独活指纹图谱峰进行比较，发现11个峰有较为明显的不同。其中，当归在49～58 min时间段无峰，独活有5个峰。变化最明显的3处为49.7、54.8、65.4 min。

分别用蛇床子素、欧前胡素、阿魏酸、二氢欧山芹醇当归酸酯对照品对指纹图谱进行指认，最终蛇床子素、阿魏酸、二氢欧山芹醇当归酸酯3个成分得以确认。指纹图谱色谱峰中未能指认出欧前胡素，可能由于欧前胡素在样品中含量较低，未能检出。

当归中加入不同比例独活指纹图谱见图6。可以看出，49～58 min时间段的5个峰均按所加独活的比例逐渐增大。同时，74.9 min蛇床子素峰、76.2 min二氢欧山芹醇当归酸酯峰也按加入独活的比例依次增大，这2个成分是独活的特有成分。可见，本方法可以很好地判断当归中是否混入了独活，且混入5%独活药材即可定性、定量判断。

3 讨论

本试验对制备供试品溶液时溶剂和提取方法的选择进行了考察，分别选用甲醇、乙醇回流提取，甲醇、乙醇超声提取。对比结果发现，采用甲醇回流提取所得图谱的色谱峰数较多、特征性强，故供试品溶液制备采用甲醇回流提取法。

本试验在190～400 nm波长扫描，同时分别设置了254、280、320、330 nm波长，通过对各成分紫外吸收图谱的分析，综合考虑基线、色谱峰数目、峰形和信号响应强度，最终确定254 nm为最佳检测波长。

本试验对流动相的组成及洗脱方式进行了优化。分别用甲醇-水、甲醇-水（含乙酸）、甲醇-水（含磷酸）、乙腈-水、乙腈-水（含乙酸）及乙腈-水（含磷酸）等体系进行洗脱，结果以乙腈-0.05%磷酸水溶液体系得到的色谱峰峰形较好且较稳定。衡比例洗脱测定时色谱峰分离效果较差，梯度洗脱法能在80 min内使大部分色谱峰得到基线分离。

与传统的性状鉴别或以药材对照品作为指标性成分鉴别的方法相比，指纹图谱鉴别方法快速、准确、简单易行，能够全面反映药材品质。本研究结果显示，当归和独活HPLC-DAD指纹图谱色谱峰存在明显差别，仿照市场上的掺伪情况，在当归粉末中加入不同比例獨活粉末，最终在指纹图谱中发现有11个色谱峰面积随加入比例的增加有较为明显的变化。本试验建立了当归、独活及当归中掺入不同比例独活的指纹图谱，方法快速、简便，采用该方法可对当归与独活进行鉴别，对掺假样品进行甄别。

参考文献：

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[M].北京：中国医药科技出版社，2015：263，133.

[2] 王元清，严建业，李顺祥，等.当归、枳壳挥发油HPLC指纹图谱的研究[J].中国实验方剂学杂志，2013，19（10）：114-118.

[3] 唐文文，李国琴，晋小军.当归不同药用部位有效成分研究[J].中国中医药信息杂志，2012，19（12）：58.

[4] 顿珠次仁，朱根华，邹志琴，等.液-质联用测定不同产地独活中蛇床子素和欧前胡素的含量[J].中药新药与临床药理，2015，26（1）：105-108.

[5] 唐文文，李国琴，晋小军.高效液相色谱法测定风湿止痛药酒中粉防己碱、防己诺林碱、蛇床子素和二氢欧山芹醇当归酸酯的含量[J].中国医院药学杂志，2014，34（8）：657-660.

[6] 李文涛，杨世海.当归质量评价研究现状[J].药物分析杂志，2013， 33（3）：517.

[7] 李成义，王延惠，魏学明，等.HPLC测定不同产地当归中阿魏酸的含量[J].西部中医药，2012，25（1）：34-36.

[8] 吴燕燕，尚明英，蔡少青，等.当归的化学成分指纹图谱[J].药学学报， 2008，43（7）：728-732.

[9] 马华侨，邸多隆，邵士俊，等.当归HPLC指纹图谱研究（I）[J].中草药， 2004，35（8）：930-932.

[10] 杨英来，崔方，吴国泰，等.当归药材不同提取部位的指纹图谱分析[J].中国实验方剂学杂志，2014，20（7）：55-60.

[11] 刘荣霞，周婷婷，董婷霞，等.建立评价当归质量的HPLC指纹图谱分析方法[J].中国药学杂志，2003，38（10）：29-32.

[12] 温学逊，牛研，王书芳.当归不同药用部位活性成分含量的HPLC分析方法及特征图谱研究[J].药物分析杂志，2014，34（2）：317-324.