液体活检技术在肺癌分子诊断中的研究进展

潘红燕

（浙江大学医学院附属第二医院 浙江 杭州 310008）

肺癌是中国发病率和死亡率最高的恶性肿瘤，由于缺乏可靠的早期诊断方法，约60%～80%的肺癌患者确诊时已属晚期，丧失了手术治疗的机会，再加上肺癌容易发生耐药和复发转移，导致十年来肺癌的总体存活率并没有得到显著增加，是当今社会严重威胁人类健康的主要因素之一[1]。虽然肿瘤组织活检仍然是肺癌诊断和获取肿瘤细胞遗传变异的首要途径，但组织活检存在着不少局限性，主要为：不少晚期肺癌患者无法进行组织活检；肿瘤的异质性导致穿刺组织无法全面反映肿瘤的整体信息；穿刺活检可能造成较大的医疗风险等[2]。近年来大量研究发现血液循环系统中存在的肿瘤遗传物质可以为肿瘤的早期诊断、基因分型提供可靠的信息，可以有效地弥补肿瘤组织活检的不足，这种从血液中获取肿瘤细胞遗传变异的途径我们称之为“液体活检”。液体活检的优势在于能够通过非侵入性取样降低活检的不良反应，因此可以进行重复检测，动态地观察患者疾病的进展，对治疗反应进行实时监测[3]。

液体活检技术中最常见的获取肿瘤DNA的来源有三种：循环肿瘤DNA（Circulating tumor DNA，ctDNA）[4]、循环肿瘤细胞（Circulating tumor cells ，CTCs）[5]以及外泌体（Exosomes）[6]。ctDNA是游离于血液中的小片段核酸，而循环肿瘤细胞是游离于血液中的可被捕获的完整肿瘤活细胞，外泌体是细胞外包含DNA、RNA、蛋白质、代谢产物等物质的小囊泡，也可被当做肿瘤的分子标记物，下文分别对ctDNA、CTCs和外泌体在肺癌分子诊断中的研究进展进行综述。

1.ctDNA在肺癌分子诊断中的研究进展

ctDNA是指肿瘤细胞因坏死或凋亡而掉落的肿瘤DNA片段，由Mandel和Metais于1940年率先提出，ctDNA会随着血液循环系统不断地流动，可以反应肿瘤基因突变、缺失、重排、甲基化等信息[7]。在肿瘤患者中，ctDNA的含量要比正常人更高[8]。由于在肿瘤形成早期血液中还没有CTCs时就已经能检测到ctDNA，因此ctDNA液体活检技术在肿瘤分子诊断中的价值大于CTCs，特别是可以通过检测ctDNA而发现早期的肿瘤。研究表明，Ⅱ～Ⅳ期的非小细胞肺癌患者ctDNA的检出率为100%，但是在Ⅰ期，仅有50%的患者被检出[9]。目前，ctDNA液体活检技术在肺癌分子诊断中已有较为广泛的应用，最常见的应用是血液EGFR基因突变状态的检测，特别是非小细胞肺癌患者接受靶向治疗过程中耐药突变T790M的检测，T790M突变同时也是第三代靶向EGFR的TKI抑制剂药物检测靶点[10]。目前，FDA与中国国家食品药品监督管理总局已批准了多款针对ctDNA的肺癌靶向药物伴随诊断试剂盒，例如厦门艾德生物科技股份有限公司基于superARMS技术的血液EGFR基因突变检测试剂盒、罗氏诊断开发的Cobas EGFR Mutation Test V2试剂盒等。

2.CTCs在肺癌分子诊断中的研究进展

循环肿瘤细胞（Circulating tumor cells，CTCs）是原发灶或转移灶细胞脱落进入外周血循环系统的游离肿瘤细胞，具有较强的流动性与侵袭性，容易粘附至血管壁并穿越，是恶性肿瘤远端转移的主要途径之一[11]。虽然有些CTCs在脱落过程中经历过上皮间质转化，但包含了原发灶肿瘤主要的细胞表型和细胞遗传变异，因此，CTCs可以成为液体活检技术获取肿瘤信息的有效途径之一。CTCs的捕获技术近年来发展较为迅速，主要捕获策略有免疫磁珠捕获技术、微流控技术、滤膜分离技术等[12]。CellSearch系统是全球第一个也是唯一经过美国食品药品监督管理局（FDA）和中国国家食品药品监督管理总局（CFDA）批准，用于恶性肿瘤疾病辅助诊断的检测CTC的产品。但其应用领域仅限于乳腺癌、前列腺癌和结直肠癌，在肺癌中其检测特异性和灵敏度均不理想，由于价格昂贵以及不能用于下游的细胞培养、基因检测等限制，强生公司在2016年初已经宣布停止销售，Cell search作为肿瘤领域无创诊断的先行者，虽然还存在着不少缺陷，却开辟了CTCs无创检查的新方向。随着未来CTCs捕获技术的进步，相信未来CTCs领域会产生更大影响力的创新无创液体活检产品。

3.外泌体在肺癌分子诊断中的研究进展

近年来，研究发现肿瘤患者外周血中的外泌体是一种新型的肿瘤生物标记物。外泌体是由细胞释放至血液中的具有完整包膜包含着母体细胞多种核酸、蛋白质等物质的小囊泡，直径大约为30～100nm[13]。外泌体是细胞与远处细胞之间信息交流的介质，因此可以在多种体液例如血液、尿液等中被检测到。由于外泌体可以反应母细胞中的遗传变异、代谢状态、生物标记物等，因此，目前以有针对外泌体而开发的液体活检检测技术，用于检测肺癌细胞中EGFR基因突变、EML4-ALK基因融合等，由于外泌体具有完整的包膜并来源于活细胞，因此相比于ctDNA而言外泌体液体活检展现出了较强的优势，特别是在肿瘤RNA的检测中优势显著[14]。然而几乎所有类型细胞都会分泌外泌体，不仅仅是肿瘤细胞，因此，外泌体的分离和检测技术还有待于进一步的完善。目前，美国Exosome Diagnostics公司针对外泌体RNA已经开发了肺癌的血液检测试剂盒。

4.总结与展望

随着液体活检技术的进步，早期肺癌的筛查已经出现了曙光。相比于影像学和传统的组织活检，液体活检技术在微创、经济、应用性方面展现出了较强的优势，但目前为止各种技术都还存在着不少问题，未来液体活检技术将在肺癌诊断、监测领域起到更加重要的作用。

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