细胞免疫荧光法在视神经脊髓炎患者血清及脑脊液中水通道蛋白-4抗体检测中的运用价值

赵鹤进

视神经脊髓炎因其严重的临床症状，极大影响了人们生活质量和生命安全，及早采取鉴别诊断就显得格外重要。随着水通道蛋白-4(anti-aquapprins-4，AQP-4)在脊髓和视神经细胞上的慢慢发现[1]，以及水通道蛋白-4抗体(APQ-4Ab)在视神经脊髓炎发病中的作用机制的认识，尤其是可以与临床症状极为相似多发性硬化进行鉴别[2]，采用合理有效的APQ-4Ab检查方法是本研究关注的重点。我们将细胞免疫荧光法(CBA)、乳胶免疫增强比浊法(PETIA)和酶联免疫法(ELISA)3种检查方法在血清和脑脊液中进行检测分析比较，为临床诊断提供实验依据，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择在2013年6月至2017年4月在我院诊断为视神经脊髓炎患者58例(NMO组)和49例多发性硬化患者(MS组)。视神经脊髓炎的诊断标准主要包括视敏度的下降、视网膜厚度减少、视觉诱发电位异常、MRI提示超过3个脊柱节段受损等[3]。多发性硬化诊断参照张星虎等人提出的诊断标准[4]。排除标准包括严重心脑血管疾病患者、合并有其他器质性神经系统疾病患者已有经过免疫抑制剂和激素治疗的患者。同时选取体检健康人群45例作为对照组。本研究经过医院伦理委员会同意，所有患者均知情同意。

1.2 样本采集 3组患者均空腹促凝管采血3 mL，3 000 r/min离心5 min，分离血清－20℃保存以备研究。NMO组和MS组患者需行腰椎穿刺留取脑脊液标本0.5 mL，3 000 r/min离心5 min，分离上清液－20℃保存以备研究。

1.3 检测方法 主要是检测(APQ-4Ab)。①CBA检测采用上海锐塞生物试剂盒，按照其说明书提供的检测步骤，将血清和脑脊液与标准细胞孵育后采用荧光显微镜观察，细胞膜出现绿色荧光为阳性结果。②PETIA检测采用上海锐塞生物试剂盒，按照说明书提供的检查步骤操作，测定散射光的变化率。以说明书提供的参考值判断阳性结果。③ELISA检测采用上海锐塞生物试剂盒，按照说明书提供的检查步骤操作，450 nm处读取吸光值，以说明书提供的参考值判断阳性结果。

1.4 观察指标 ①3组人群和3种检测方法APQ-4Ab阳性率的比较。②敏感性和特异性的比较，敏感性＝检测阳性人数/(真阳性人数＋假阴性人数)×100%。特异性=检测阴性人数/(真阴性人数＋假阳性人数)×100%。

1.5 统计学方法 应用SPSS 22.0统计学软件进行数据的分析和处理。计量资料采用(±s)表示，计数资料采用[n(%)]表示。计量资料采用t检验，计数资料采用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3组患者一般资料比较(表1) 经卡方检验，各组在性别和病程上差异无统计学意义(P＜0.05)，方差分析显示，3组在年龄上差异无统计学意义(P＞0.05)，具有可比性。

表1 3组患者一般资料比较[n，(±s)]

表1 3组患者一般资料比较[n，(±s)]

组别 例数 性别(男/女) 年龄/岁 病程/月NMO组 58 28/30 43.7±5.9 12.3±2.6 MS组 49 24/25 44.6±5.7 11.8±3.3对照组 45 23/22 43.2±6.1 χ2/F值 1.65 2.61 0.89 P值 ＞0.05 ＞0.05 ＞0.05

2.2 3种检测方法在不同分组血清APQ-4Ab阳性率的比较(表2) 虽然3种检测方法在NMO组、MS组和对照组中APQ-4Ab的检测阳性率均有差异(χ2＝11.64，8.52，7.49，P＜0.05)，但是在NMO组中，CBA法检测APQ-4Ab的阳性率为81.1%，高于PETIA法的55.2%和ELISA的43.1%(χ2＝6.23，P＜0.05)。在MS组中，3种检测方法差异无统计学意义(χ2＝1.17，P＞0.05)。3种检测方法在对照组中APQ-4Ab阳性率均为0。

表2 3种检测方法在不同分组血清APQ-4Ab阳性率的比较

2.3 3种检测方法在不同分组脑脊液APQ-4Ab阳性率的比较(表3) 同样3种检测方法在NMO组、MS组脑脊液中APQ-4Ab阳性率均有差别(χ2＝7.92，8.24，8.15，P＜0.05)，但是在NMO组中，CBA法检测APQ4-Ab的阳性率为84.5%，高于PETIA法的58.6%和ELISA的48.3%(χ2＝10.52，P＜0.05)，在MS组中，3种检测方法差异无统计学意义(χ2＝0.84，P＞0.05)。

表3 3种检测方法在不同分组脑脊液APQ-4Ab阳性率的比较[n(%)]

2.4 3种检测方法在NMO组血清和脑脊液检测APQ-4Ab的敏感性和特异性比较(表4) 本研究计算的是NMO组血清和脑脊液总敏感性和特异性，结果可见，CBA的敏感性为83.1%，高于PETIA的62.4%和ELISA的57.6%(χ2＝6.85，P＜0.05)。3种检测方法的特异性都可达到90%以上，但差异无统计学意义(χ2＝0.78，P＞0.05)。

表4 3种检测方法在NMO组血清和脑脊液检测APQ-4Ab的敏感性和特异性比较 单位：%

3 讨论

视神经脊髓炎又称Devic综合征，是视神经和脊髓同时或相继受累的急性或亚急性脱髓鞘病变，好发于青状年，儿童也有常见，男女均可发病。临床多表现为不同程度的视力敏感度下降、甚至失明，感觉丧失，下肢瘫痪等。短时间的视力障碍和瘫痪是本病的特点[5]。发病机制不详，可能原因是与病毒感染导致机体自身免疫系统功能混乱，造成视神经和脊髓脱髓鞘病变。临床诊断检测方法主要包括眼部和脊髓神经检测、血清和脑脊液分析和影像学检查，是多系统联合检查完成对其诊断。在以往的研究中，由于临床症状的相似性，视神经脊髓炎被误认为是多发性硬化的一种亚型[6]，但随着医学的发展，慢慢发现视神经脊髓炎在影像学、血清学检查等与多发性硬化都有很大的不同。MRI检查上，视神经脊髓炎受损的脊髓节段往往在3个或3个以上，称之横贯性脊髓炎，而多发性硬化的病灶多在大脑半球上，脊髓很少受损超过3个。血清学检查上，APQ-4Ab是能够早期区别视神经脊髓炎和多发性硬化的检测指标，并对视神经脊髓炎指导用药、预后、复发等均有重大价值[7]。APQ-4是分布在中枢神经系统的水通道跨膜转运蛋白上，在大脑、脊髓和视神经均有可见。不同部位的APQ-4发挥不同功能，共同参与脑脊液分泌和重吸收，以及维持大脑神经细胞内外离子平衡[8]。APQ-4Ab又称视神经脊髓炎特异性抗体(NMO-lgG)。病理状态下，APQ-4Ab能激活补体系统，导致视神经和脊髓脱髓鞘炎性病变，可破坏血脑屏障、诱导星型胶质细胞死亡、中枢系统神经元丢失等[9]。同时也支持视神经脊髓炎是一种主要由体液免疫介导的自身免疫性疾病。

CBA是将荧光素标志在已知的细胞抗原或抗体上，在与相应抗体进行特异性结合，在细胞上形成含有荧光素的抗原抗体复合物，通过显微镜可以直接观察荧光反应来判断结果。这种检测方法具有检测速度快、准确性高、敏感性和特异性强的优点。而常规的抗原抗体结合检测方法如PETIA和ELISA存着一些问题，如前带后带现象、脂血溶血、比色杯和光源对检测的影响，导致准确性和敏感度上有一定缺陷[10]。本研究主要进行比较了CBA、PETIA和ELISA这3种检查方法对于APQ-4Ab检测能力的比较。从确诊的NMO患者、MS患者以及健康人群的分组中可以看到，这3种方法在3组人群的血清和脑脊液中APQ-4Ab检测均有差异性，提示这3中检查方法都可以在一定程度上用于视神经脊髓炎的鉴别和诊断。但是在确诊的NMO组中，无论是脑脊液还是血清中，CBA对于APQ-4Ab检测的阳性率均高于PETIA和ELISA，可以说明CBA对于APQ-4Ab的检测准确性还是高于常规的抗原抗体检测方法。在检测敏感性上，CBA法的敏感性为83.1%，高于PETIA和ELLISA法。而在特异性上，3种检测方法几乎差距不大，都在90%以上，进一步证明细胞免疫荧光法对于水通道蛋白-4抗体检测的重要性。

综上所述，CBA在视神经脊髓炎患者血清及脑脊液中APQ-4Ab检测中具有较高的准确性，且敏感性和特异性俱佳，值得在临床上大力推广。

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