848例结核标本DNA微阵列法检测探讨

李开吾

（盐城市第二人民医院 江苏 盐城 224002）

世界范围内随着各种因素，特别是环境因素的不断改变，全世界的结核预防及控制工作显得非常紧迫，在新技术、新方法不断推陈出新的情况下：出现了LAMP、XPERT、以及PCR等系列的方法学，DNA微阵列基因芯片法，在临床试验中的应用，得以在我科开展，现就我市的开展情况作如下的探讨。

1.材料

（1）所有试剂均为博奥公司提供的成品，同时提供了全套设备包括：扩增仪，杂交恒温仪，洗涤干燥仪，恒温振荡仪，金属浴，快速提取仪，微量离心机。（2）自备的有4.0%NaOH、N-乙酰-L-半胱氨酸，蒸馏水，生理盐水，移液器，吸头，8连排管等。（3）病源标本为我院接收的全市7县区的痰检样本及罗氏培养菌株，计848例，其中痰样本769例，菌株79例，年龄段在21至86岁之间，男性596例，女性252例。

2.方法

博奥公司提供的结核分枝杆菌DNA微阵列法的操作流程：

（1）标本准备：按照操作规程要求，按留取的痰检后标本，LAMP检测的标本，XPERT检测的标本，以及罗氏培养后的菌株标本，镜检结果在：2～5条/300HP、1+、2+到4+不等[1]。

（2）液化处理：采用0.5%N-乙酰-L-半胱氨酸的4%NaOH加等量处理液化、振荡及36℃恒温箱中放置不同时间，观察液化状况，以及后续加0.5%酚酞指示剂和4%HCL处理等过程。观察到吸取不粘稠，吸出不成丝，吹出呈点滴状备用[1]。

（3）提取核酸标本：液化好的标本吸取1ml放入离心管中，12000rpm/分，离心6分钟，弃去上清液，再加入1ml生理盐水洗涤振荡至底物漂浮上来后，离心12000rpm/分，6分钟，取出，吸取上清液弃去，尽量吸干净，加入50ul的核酸提取液，菌株直接挑取一个菌落于提取管中，用移液器直接混匀吸入后移至提取管中，盖好后振荡10分钟，放入金属浴5分钟裂解，取出离心10000rpm/分，1分钟备用[3]。

（4）扩增：准备所需检标本数的3排8连排管，室温或36℃ 温箱中融化酶试剂PCR1.2.3，每管加酶试剂18ul，再加提取液4ul，加盖后离心瞬间10000rpm/分，打开扩增仪，设置程序，扩增2小时44分，后在扩增仪中95℃变性10分钟，取出放入冰水混合物中5分钟备用。

（5）杂交：准备杂交盒及微阵列芯片及8连排管2排，将杂交混合液取出放入室温回复至复融状态，每管加样9ul，按顺序加入扩增DNA模板1+2；1+3液各4ul于相应的8连排管中，混匀备用，点样，吸取12.5uL分别为rpo B和KatG及inhA DNA模板液于芯片小孔内，然后轻轻振荡后，加盖闭合后放入恒温杂交仪中杂交2小时取出[4]。

（6）洗涤：取出杂交盒，打开取出芯片置于片架上，放入准备好的洗涤仪中清洗，待清洗完后，取出放入干燥仪中干燥5分钟取出备检。

（7）判读结果：打开荧光判读仪及电脑进入程序，并输入数据及信息，插入芯片，开始检测，判读荧光数值及结果判读，确定其类型。

3.结果分析

2017年8月26日—2018年5月31日间共检测848例我市7县区的结核临床、门诊标本。①野生型：451例，占53.18%；②双特变型人数为61例，为7.19%，单突变数59例，其中rpoB型31例占3.66%，KatG 或inhA为28例，占3，30%；③TB.DNA＜1000数为125例，占14.74%；④分枝杆菌数54例，占6.37%；⑤样本异常数（条带不正常）79例，占9.32%；⑥复检数19例，占2.24%；⑦复检成功8例，占42.11%；总突变数120例，占14.15%。上述的分布情况即为结核3种基因型微阵列法的检测情况。

4.讨论

通过结核分枝杆菌DNA微阵列法检测全市此期间的848例标本，初步得出此时间段的我市结核病人的分布情况以及耐药基因的出现率；同时提供给临床及时实验数据，指导临床进行合理的用药及治疗，减少对病人用药的盲目性，更具临床针对性，为我市的近期结核预防提供有用的流行病学资料。