水库沉积物氨氧化微生物丰度研究

李 雪

（1.辽宁省鞍山水文局，辽宁鞍山 114039；2.大连理工大学，辽宁大连 116024）

0 引言

氨氧化微生物主要包括氨氧化细菌（AOB）和氨氧化古菌（AOA），是氨氧化过程中起主要作用的角色，氨氧化过程是硝化反应中一个环节，而硝化作用又是氮循环过程中关键的步骤，所以，氨氧化微生物的研究对更好地了解氮循环至关重要。硝化反应的实质就是在微生物的作用下，将氨氮转化为硝氮的过程。在氨氧化过程中，氨单加氧酶基因（amoA）编码的酶起至关重要的作用[1]，人们一直认为只有氨氧化细菌含有这种基因，直到海洋中分离出来了第一株泉古菌，人们才意识到了不是只有氨氧化细菌才有这种功能。逐渐的，氨氧化古菌被人们认为存在于多种生境中。多年以来，关于AOB、AOA在各种生境中的丰度得到了深入而广泛的研究。Wang[2]等人在对水库沉积物和邻近土壤进行研究时发现AOA最高丰度依次出现在无植被生长的河边土壤、水库沉积物、种植芦苇的河边土壤和农田土壤。Liu等人发现在三峡水库好氧缺氧交替进行的条件下，AOA更适应生存[3]。

当前对于淡水生境例如饮用水水库沉积物中在氮循环中起作用的微生物的研究较少，碧流河水库是大连市重要的水源工程，由于水库水土流失严重，每一年都有大量的氮、磷、钾、农药等随着泥沙流入该水库，有潜在的可能会破坏水库中氮循环的平衡，甚至会造成水体富营养化。为了掌握水库氮循环及氮代谢情况和维持生态稳定，本课题主要针对辽宁省大连市碧流河水库库区沉积物中参与氮循环的微生物AOA和AOB的丰度进行研究，探究在不同的环境条件影响下秋季平水期和春季枯水期水库沉积物中AOA和AOB丰度的变化情况。

1 概述

AOB是氨氧化过程中起关键作用的微生物，属于变形菌的β和γ亚纲。AOB的存在范围可分为淡水沉积物、污水、土壤和海洋4个生态类群。为了维持各类生态系统的平衡，环境因子对AOB影响已被广泛研究。铵作为AOB的底物，与AOB的丰度有着密切的联系，AOB的丰度与铵的浓度呈正相关[4]。AOB的丰度受pH的影响，季节的改变和降雨的多少也会改变pH和AOB的相关性。pH较低时，铵被转化为氨，改变底物浓度，从而改变AOB的丰度[4]。温度对AOB丰度的影响，要根据实际的情况来分析。生物酶要求合适的温度才能发挥作用，不同物种往往有其最适生长温度，所以温度变化会影响AOB丰度。深度对沉积物中AOB的丰度影响显著，可能与其不同深度溶解氧不同有关，氧的可利用性对于海洋、湖泊、土壤和沉积物等各类生境中AOB丰度及其重要。微生物能分解有机物质，促进腐殖质的形成，一般来说，水生系统中微生物的数量与有机质的含量呈正相关。

AOA在土壤、淡水、沉积物等各类生态环境中被广泛关注，并在自然界中起到了关键作用。近年来，微生物学一个显著的成就就是发现了常温型泉古菌中的一个功能类群—氨氧化古菌。AOA在铵浓度低时更加活跃，AOA适宜生长的温度比较宽泛，在低温或者非常高的温度环境下，AOA的分布比较广泛。在多数土壤环境中，当pH值低至3.7时，AOA比AOB更占优势，AOA的丰度随着pH的升高而降低[5]。

2 实验方法

该课题研究的沉积物样品分别取自2014年10月秋季平水期和2015年4月春季枯水期的碧流河水库库区，主要对碧流河水库上游、中游和下游的10个不同地点进行取样。

2.1 沉积物样品理化指标的测定

对实验样品主要测的指标有：温度、氨氮、水深、硝氮、亚硝氮、pH值、有机质。取一部分沉积物样品，在50℃的条件下烘干后研磨，并用1 mm筛滤过。滤过的烘干土样用饱和氯化钾溶液处理，然后采用纳氏试剂光度法和离子色谱测其氨氮、硝态氮和亚硝态氮的含量，采用PHS-25型酸度计测其pH值，利用重铬酸钾氧化法测定有机质含量。

2.2 沉积物中amoA基因定量分析实验

1）沉积物样品的DNA提取与检测

利用土壤微生物DNA强力提取试剂盒来提取沉积物样品的DNA，提取的DNA浓度以及纯度用微量分光光度计测定。

2）标准质粒的培养与定量

首先选取含有AOB和AOA的沉积物，提取DNA，然后进行聚合酶链式反应、割胶回收、链接克隆挑菌，把挑出的菌放到培养基里培养，之后采用质粒提取试剂盒提取质粒，最后用仪器超微量紫外分光光度计测定提取的质粒的浓度和纯度，标准质粒的拷贝数的计算公式如下[6]：

6.02×1023（拷贝数/mol）×浓度（g/ml）/MV（g/mol）=拷贝数/ml

其中，MV=3 000 bp×660 dalton/bp=1.98×106daltons

最后把提取的标准质粒放到-20℃的条件下保存用于接下来的实验。

3）AOB和AOA的amoA基因荧光定量分析实验

用定量反应的试剂和引物[7]以及提取好的质粒做AOB和AOA的定量实验,定量反应均在定量分析仪上进行，荧光定量反应引物及反应条件见表1、反应组分见表2，最后对荧光定量实验的最终数据进行准确的分析，从而得出AOB和AOA的拷贝数。

表1 实验使用的引物和反应条件

表2 荧光定量实验反应组分（AOA和AOB）

2.3 统计学分析方法

实验主要利用软件统计产品与服务解决方案（SPSS）中的皮尔森相关性统计学方法分析AOA和AOB丰度和沉积物理化因子之间的关系。

3 库区沉积物氨氧化微生物丰度研究

3.1 沉积物理化指标性质初步研究

水库沉积物对水库水质有重要影响，并且氨氧化微生物的生长和丰度有可能受到沉积物环境因素的影响，所以了解沉积物所处的环境条件有助于更好地分析沉积物中AOA和AOB的丰度受环境因子影响的变化情况。课题选取的是碧流河水库库区沉积物，2个时期各个采样点的详细资料和理化指标见图1。

图1 碧流河水库库区8个采样点的理化性质

实验中各个采样点分别来自碧流河水库库区上中下游不同位置。从图1中可知沉积物中亚硝氮的含量较低，可以忽略。2个季节沉积物中的氨氮含量均为下游最多，中游次之，上游最少，硝氮的浓度都很低。同一个季节，不同采样点水深、氨氮和有机质3个环境因子差异较大，而其他的环境因子之间的差异较小；同一个采样点，不同季节温度和氨氮2个环境因子差异较大，而其他的环境因子之间的差异较小。

3.2 沉积物中AOB和AOA的基因定量分析实验

3.2.1 沉积物的DNA提取结果与分析

各个样品提取的DNA的浓度在13.1～28.5 ng/μl，纯度较高。

3.2.2 沉积物中AOB和AOA的amoA基因定量结果分析

分别对AOA和AOB的amoA基因的质粒进行1∶5的等梯度稀释，用稀释得到的5个标准点绘制标准曲线，在实验中得到R2≥0.98的标准曲线。荧光定量标准曲线的详细结果见表3，标准曲线准确性良好。

表3 AOA和AOB的amoA基因荧光定量实验标准曲线结果

图2 采样点沉积物中AOB和AOA的amoA基因数量比较结果

在碧流河水库库区16个样品中，两个季节均含有大量amoA基因。根据图2（a）得出，2014年10月秋季平水期样品沉积物中AOB的amoA基因拷贝数在8.07×107～1.81×109拷贝数/克干土之间，而AOA的amoA基因拷贝数在2.12×107～8.92×108拷贝数/克干土之间，AOB的amoA基因拷贝数大于AOA，多出了1～2个数量级，秋季平水期不同采样点之间的AOB和AOA的丰度的差异很大。从图1（b）得出，2015年4月春季枯水期样品沉积物中AOB的amoA基因拷贝数在1.13×108～1.18×109拷贝数/克干土之间，而 AOA 的amoA基因拷贝数在3.58×107～1.01×108拷贝数/克干土之间，AOB的amoA基因拷贝数明显多于AOA，同样多出了1～2个数量级，春季枯水期不同采样点之间的AOB和AOA的丰度的差异也很大。总体来看，沉积物中AOB的丰度大于AOA，在碧流河水库库区沉积物氨氧化过程中更占优势，先前的研究表明在很多环境中AOB多于AOA，在红树林沉积物、河流沉积物和氨氮污染的湿地(潮滩)[8]中，AOB更有优势，与此次实验研究结果一致。两个季节AOB丰度最高值出现在氨氮浓度高的库区下游地带。

图3 2014年10月和2015年4月同一采样点底泥沉积物中AOB和AOA的amoA基因数量比较结果

由图3可以看出，2014年10月秋季沉积物样品中的AOB的丰度普遍高于2015年4月春季样品的，2014年10月库区沉积物中AOA的丰度普遍低于2015年4月，总体来看，AOB的丰度增加的同时AOA丰度减少了，这也更加证明了AOB和AOA存在竞争关系。实验中，AOA和AOB的丰度对于季节的变化并不明显，表明了AOA和AOB的丰度对于两个时期水库环境的改变适应性很强。

3.3 沉积物中AOB和AOA的丰度与环境因素之间的相关性分析

运用皮尔森相关性分析的是每个地点的AOA和AOB丰度与环境因素的之间相关性。结果见表4：AOB的丰度与温度呈显著的负相关性，而与水深、有机质、氨氮、亚硝氮均呈正相关性；AOA的丰度随着硝氮的升高而降低。

近些年来，很多科学家探索了pH对于AOA和AOB丰度的影响，该课题得出的结论是pH与AOB和AOA的相关性不大，可能是因为采样点pH差异不大导致的。实验发现AOB的丰度与氨氮呈一定的正相关性，而AOA的丰度随氨氮浓度升高而降低。亚硝氮与氨氮类似，是氨氧化过程的反应基质，大多数情况下，正如实验中研究发现一样，亚硝氮对于AOB呈正相关性。

表4 AOB和AOA丰度和环境因素的相关性分析

研究发现，水深对AOB呈正相关，随着深度的增加，氧的含量越少，AOB对氧的竞争能力越差。之前研究表明AOB丰度随着水深的增加而减少[9]，而此次实验得到的结果却是相反的，可能是由于其他环境因素影响导致的。有机质对AOB呈正相关，但是与AOA呈负相关，可能是因为其他环境因素对AOA共同影响导致的。

4 结语

1）碧流河水库库区沉积物中含有大量氨氧化微生物，AOB的丰度大于AOA，说明AOB在碧流河水库库区沉积物氨氧化过程中更占优势，也充分说明了AOB对于碧流河水库库区沉积物的适应性更强。2014年10月秋季沉积物中的AOB的丰度高于2015年4月春季样品的，而2014年10月秋季沉积物中AOA的丰度少于2015年4月春季样品的，总体来看AOB丰度增加的同时AOA减少了。

2）AOA和AOB的丰度受环境因素的影响不同，AOB与温度呈一定的负相关性，而与水深、有机质、氨氮、亚硝氮均呈一定的正相关。AOA与硝氮呈显著的负相关。表明两个时期的样品中AOA和AOB的丰度受到多个环境因素的共同影响且受到的主要环境影响因素不一致。

［1］刘正辉，李德豪.氨氧化古菌及其对氮循环贡献的研究进展［J］.微生物学通报，2015（04）：774—782.

［2］Wang,X,et al.,Abundance and community structure of ammonia-oxidizing microorganisms in reservoir sediment andadjacentsoils［J］.AppliedMicrobiologyandBiotechnology,2014，98（4）：1883—1892.

［3］Kuypers M M M,Sliekers A O,Gaute L,et al.Anaerobic ammonium oxidation by anammox bacteria in the Black Sea［J］.Nature，2003，422：608—611.

［4］Gerrity S,Clifford E,Kennelly C,et al.Ammonia oxidizing bacteria and archaea in horizontal flow biofilm reactors treating ammonia-contaminated air at 10 degrees C［J］.Journal of Industrial Microbiology&Biotechnology.2016，43（5）：651—661.

［5］Erguder,T.H,et al,Environmental factors shaping the ecological niches of ammonia-oxidizing archaea［J］.Fems Microbiology Reviews，2009，33（5）：855—869.

［6］LimJ,ShinS.G.,LeeS,etal.Designanduseofgroup-specific primers and probes for real-time quantitative PCR［J］.FrontiersofEnvironmentalScience&EngineeringinChina.2011，5（1）：28—39.

［7］洪义国，李猛，顾继东.海洋氮循环中细菌的厌氧氨氧化［J］.微生物报，2009，49：281—286.

［8］Zheng Y L,Hou L J,Liu M,et al.Diversity,abundance,andactivity of ammonia-oxidizing bacteria and archaea in Chongming eastern intertidal sediments［J］.Applied Microbiology andBiotechnology,2013，97（18）：8351—8363.

［9］岳冬梅，田梦，宋炜，等.太湖沉积物中氮循环菌的微生态［J］.微生物学通报，2011，38（4）：555—560.