PERK通路在心肌缺血再灌注损伤中的研究进展

陈玉姣，陈 慧

(遵义医学院 麻醉医学院，贵州 遵义 563099)

心肌缺血再灌注损伤(myocardial ischemia-reperfusion injury，MIRI)是指在短时间内心肌血供中断，一定时间内恢复血供后，原缺血心肌发生较缺血前更为严重的损伤[1]。对于缺血心肌组织，及时恢复血流供应是急性期治疗的主要目标，矛盾的是，缺血组织的再灌注可导致广泛的微血管功能障碍、自由基爆发、钙超载、线粒体损伤、腺苷三磷酸能量代谢障碍、细胞自噬、细胞凋亡和坏死[2]。随着研究的不断深入，发现MIRI是一个长期而复杂的病理过程，其机制涉及广泛的基本生物学变化，包括离子、炎症、氧化应激、线粒体功能障碍和细胞凋亡[3]，其中内质网应激(endoplasmic reticulum stress，ERS)介导的促生存与促凋亡“双相”作用机制参与MIRI的发生与发展是当下的研究热点。位于内质网上的I型跨膜蛋白蛋白激酶R样内质网激酶(protein kinase R—like ER kinase，PERK)作为内质网应激感受器，其调控的信号通路在MIRI中占有重要地位[4]。因此，本文就PERK通路与MIRI的关系作一综述，旨在为MIRI潜在发病机制提供新思路，以及为靶向药物治疗的研发提供新方向。

1 PERK及其通路组成的结构与功能

内质网(endoplasmic reticulum，ER)是一种多功能细胞器，在调节各种细胞生理功能中扮演着重要的角色，包括参与蛋白质的翻译、折叠，调节钙稳态，合成脂质和固醇，维持细胞功能动态平衡[5]。研究表明[6-7]多种因素如缺血、缺氧、氧化应激、钙超载、细胞自嗜等刺激可导致内质网内蛋白质折叠紊乱，出现错误折叠蛋白或未折叠蛋白质异常聚集在内质网腔，从而触发内质网发生应激反应，即内质网应激。当内质网应激发生时，细胞通过减少自身蛋白质的合成、促进蛋白质的正确折叠，以及增加内质网相关性蛋白降解途径，减轻内质网负荷，这些适应性反应统称为未折叠蛋白反应(unfolded protein response，UPR)[8]。在真核细胞中，UPR通过内质网上3种跨膜蛋白激活：肌醇依赖酶1 (inositol-requiring enzyme 1，IRE1)、转录激活因子6(activating transcription factor 6，ATF6)及PERK，这是UPR介导的3条通路，其中PERK通路主要参与抑制未折叠和错误蛋白质的翻译及异常积聚，是目前研究比较广泛且深入的ERS凋亡途径[9]。PERK是位于内质网上的I型跨膜蛋白，属于真核细胞翻译启动的成员因子2α激酶亚科，其自磷酸化及低聚化可影响内质网应激，且PERK与IRE1有相似的结构域，表达丝氨酸-苏氨酸蛋白质激酶活性，参与调节GCN2激酶(general control non-derepressible-2)和真核细胞翻译起始因子2α(eukaryotic initiation factor 2a，eIF2α)激酶活性[10]。在无应激状态下，PERK与ERS标志性蛋白葡萄糖调控蛋白78(glucose regulated protein，GRP78)结合形成复合物，处于未活化状态。当内质网腔错误折叠或未折叠蛋白质异常积聚被PERK感知时，使得PERK在稳定的二聚体与具有活性的四聚体之间迅速转换，四聚体中的疏水基使PERK发生自磷酸化，自磷酸化的PERK使内质网外侧的eIF2α发生磷酸化修饰，一方面通过eIF2α 磷酸化抑制蛋白质合成及mRNA翻译，另一方面激活下游参与调节的转录激活因子4(activating transcription factor 4，ATF4)，ATF4 合成后转位至细胞核内[11]。eIF2α作为真核细胞转录起始因子，具有三个亚基：α、β、γ。在蛋白质合成早期，eIF2α与GTP和蛋酰胺tRNA结合形成三元复合物，三元复合物与40S核糖体亚基结合形成43S翻译起始复合物，继之翻译起始物水解并释放eIF2α-GDP二元复合物，为了eIF2α循环以及催化另一轮启动，eIF2α-GDP复合物通过eIF2β的催化反应与GTP发生转换反应，而p-eIF2α绑定到eIF2β，稳定eIF2α / GDP /eIF2β复合物并防止eIF2α-GDP回收eIF2α-GTP。较低eIF2α的水平抑制了43S翻译起始复合物的组装并防止错误折叠或未折叠蛋白质的合成及翻译，从而在内质网应激早期中断eIF2α循环利用[12]。ATF4作为转录激活因子，涉及蛋白质折叠、氧化反应、细胞自噬和细胞凋亡。在内质网应激状态下，p-eIF2α通过真核生物 mRNA 5′非编码区上游可译框(uORF)促进ATF4翻译，上调内质网分子伴侣蛋白GRP78、钙网蛋白(calreticulin，CRT)等的表达；参与氨基酸转运蛋白质的转录表达；并诱导C/EBP环磷酸腺苷反应元件结合转录因子同源蛋白(C/EBP homologous protein，CHOP)转录和生长停滞与DNA损害可诱导基因34 (growth arrest and DNA damage-inducible protein 34， GADD34)表达，其中CHOP的转录被认为是控制促细胞凋亡的回应[13]，而GADD34的表达则有助于eIF2α与磷酸酶PP1c结合去磷酸化，促进翻译恢复，维持内质网稳态[14]。此外，ATF4通过一系列转录可改变ERS相关氧化还原性，影响具有抗氧化活性的二硫键形成，使钙结合伴侣钙粘蛋白、钙网蛋白和蛋白质折叠酶增加，并诱导ERS相关蛋白的表达，增加蛋白质折叠能力及增强对氧化应激的抵抗能力[15]。众所周知，ATF4促凋亡的转录因子是CHOP，其被称为凋亡因子及DNA损伤诱导蛋白153，属于CCAAT /增强子结合蛋白(C / EBP)转录因子家族[16]，是参与心血管疾病中内质网应激凋亡信号通路的生物标志物，主要受抗凋亡蛋白Bcl-2(B-cell lymphoma-2)家族的控制[17]。正常情况下，CHOP处于低表达状态。ERS状态下，PERK/ATF4信号通路通过激活CHOP，使促细胞凋亡转录因子碱性亮氨酸拉链(basic region/leucine zipper motif，bZIP)过度表达，同时抑制抗凋亡Bcl-2基因的表达以加速细胞死亡。CHOP除了增强促凋亡成员的表达，还增加蛋白质合成和氧化应激[18]。

2 PERK通路在MIRI中的作用

研究表明[19]MIRI使未折叠蛋白质异常积聚在内质网腔中，可引起PERK自磷酸化，早期其被认为是一种保护性反应，一方面减弱了蛋白质的合成，另一方面促进内质网内蛋白质正确的折叠或降解异常积聚的错误折叠蛋白，但随着内质网蛋白折叠持续受阻，磷酸化PERK则激活其下游细胞凋亡通路促进细胞程序性死亡，造成组织损伤[20]。目前关于PERK通路对MIRI作用的研究主要有以下方面。

2.1 PERK通路参与药物处理的心肌保护作用 Wei等[21]通过开胸结扎大鼠左前降支冠状动脉建立急性心肌梗死模型，证实缺血再灌注心肌激活了PERK和eIF2α的磷酸化，使下游CHOP表达增加，进而减少了抗凋亡因子Bcl-2的表达，进一步加重心肌损伤，然而经腹腔注射精胺预处理后，内质网应激相关蛋白GRP78、p-PERK、p-eIF2α、CHOP表达减少，心肌细胞凋亡减少，这与给予PERK抑制剂GSK2656257处理乳鼠心肌细胞后保护缺血再灌注损伤心肌的结果一致。 Zhang等[22]通过建立在体大鼠心肌缺血再灌注模型，在缺血前10分钟使用UPR刺激剂二硫苏糖醇(DTT)，观察到GRP78、CHOP mRNA和蛋白水平的增加，与缺血再灌注损伤组结果一致，因此PERK凋亡通路激活可能在介导MI/R后ERS诱导的细胞凋亡途径中发挥关键作用，同时经过在缺血前60min给予UPR抑制剂4-苯基丁酸(4-PBA)，发现ERS相关蛋白GRP78、CHOP表达减少，心肌梗死面积及心肌细胞凋亡率较I/R及I/R+DTT减少，进一步证实UPR介导的PERK通路可能在缺血再灌注损伤心肌中占有重要地位。Jian等[23]通过Langendorff装置对大鼠离体心脏进行全心缺血再灌注，发现I/R诱导ERS标志性蛋白GRP78及PERK通路标志性蛋白PERK的过表达，引起心脏功能障碍，而经4-PBA处理后改善了I/R诱导的心肌细胞凋亡，因此4-PBA可能通过抑制GRP78的过度表达和PERK的磷酸化来延缓ERS的发生，以此达到心肌保护。同时，在细胞学实验中，Jian等[24]将大鼠H9c2心肌细胞在缺血培养液中培养6 h后，取出于DMEM中培养12h以模拟再灌注，表明I/R诱导ERS相关途径及其下游凋亡靶点PERK、CHOP的增加，影响内质网腔内的平衡，结果显示4-PBA处理后，能有效抑制PERK介导的凋亡途径，对降低心肌细胞凋亡和预防I/R诱导的细胞死亡具有一定保护作用。Li等[25]研究表明经毒胡萝卜素(TG)处理新生大鼠原代培养的心肌细胞，触发ERS相关蛋白GRP78、CRT、PERK、eIF2α的表达，经西洋参茎叶总皂苷(PQS)预处理和PERK敲除显著抑制TG诱导的心肌细胞凋亡，增加细胞活力，PERK和eIF2α的磷酸化水平均降低，ATF4和CHOP蛋白水平降低，表明PERK通路参与了TG诱导的凋亡，PQS可能通过抑制该通路阻止TG诱导的心肌细胞凋亡。

2.2 PERK通路参与缺血预/后处理作用 Alan等[4]通过对雄性小鼠建立在体MIRI模型，分别测量经过6个循环冠状动脉闭塞和再灌注的缺血预处理后30min和24h心脏缺血区域UPR组分的变化，证实缺血预处理30min导致ER上I型跨膜蛋白PERK磷酸化的增加，且蛋白印迹分析显示缺血预处理后24h ATF4蛋白显著增加，表明缺血预处理激活缺血再灌注心肌ERS的早期保护性阶段，即PERK依赖性信号通路，以此增强心肌对缺血的抵抗力。皱麓等[26]通过Langendorff装置建立大鼠离体MIRI模型，结果显示I/R组PERK通路标志性分子磷酸化PERK表达量显著增加，经缺血后处理发现PERK通路相关蛋白的表达被抑制，因此缺血后处理可能通过下调PERK通路介导的ERS相关凋亡蛋白的表达，减轻大鼠离体MIRI。

2.3 PERK通路参与运动训练的心肌保护作用 运动训练被认为是降低MIRI风险的有效措施，然而，运动训练对MIRI引起ERS的有益影响则取决于运动的类型及持续时间[27]。在动物实验中，跑步机运动训练可通过下调GRP78、p-PERK、p-eIF2α、ATF4、CHOP的表达， 减少心梗面积，改善心脏功能[28]。 Guillaume等[29]建立睡眠呼吸暂停综合征引起的慢性间歇性缺氧(IH)大鼠模型，通过Langendorff装置进行全心缺血再灌注，表明IH诱导心肌细胞凋亡前的持续内质网应激，其特征是分子伴侣GRP78上调，PERK和eIF2α磷酸化增加，ATF4、ATF6和CHOP表达增加，由此下调抗细胞凋亡表达因子Bcl-2，及上调细胞凋亡因子Bax，最终表现为心肌细胞凋亡，经短时间高强度有氧运动训练，可能通过下调UPR适应性途径PERK凋亡通路防止IH依赖性MIRI后的心肌梗死，降低动脉血压，保护血管内皮功能，改善心功能。研究表明[30]递增运动时间的耐力训练，可激活运动心肌PERK/eIF2a/ATF4信号通路介导的ERS，但CHOP和Caspase 12的表达并没有升高，表明该ERS并没有导致运动心肌的凋亡；因此，递增运动时间的耐力训练激活PERK/eIF2a/ATF4信号通路的生理意义可能在于减少新合成蛋白质进入内质网，进而降低内质网对新蛋白质折叠需求的压力，以便维持细胞稳态，从而起到对缺血再灌注心肌的保护。

3 展望

目前，对于PERK信号通路在心肌保护的影响进行了部分研究，其促细胞生存及促细胞凋亡的“双相”作用可能成为干预心肌缺血再灌注损伤的重要靶点。虽然众多实验研究对PERK信号通路和MIRI之间的关系进行了研究，但在PERK通路参与MIRI的病理生理学改变中，确定保护性自我适应与损伤性凋亡之间的阈值，目前仍然不明确。且大多数研究是在正常动物模型中进行，而缺血性心脏病患者常伴有高血压、糖尿病、高血脂等合并症，因此正常动物模型的实验结果尚不能完全代表人类患者的情况。因此，尽管动物实验研究发现药物、缺血预/后处理及运动训练可通过调节PERK通路改善心肌缺血再灌注损伤，但未来仍需要相关的临床实验加以佐证。

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