柯因的肝保护效果及其作用机制研究进展

何燕 徐梦婷 季超 季剑 季福标 叶满红 周斌

（1 扬州大学动物科学与技术学院，扬州 225009；2 扬州大学生物科学与技术学院，扬州 225009；3 江苏日高蜂产品有限公司，淮安 211700）

肝脏疾病，包括（非）酒精性脂肪肝、肝炎、肝纤维化、肝硬化、肝癌等，在全世界范围内都具有相当高的发病率和死亡率，严重威胁人类健康。临床上有多种药物针对不同的肝损伤形式进行针对性治疗，然而鉴于化学药物不可避免的副作用，各具其局限性，因此，越来越多的研究者致力于从天然产物粗提物或纯化产物中寻找并开发可用于肝脏疾病的、与药物治疗互补甚至是替代的物质。

柯因（5,7-二羟黄酮），英文chrysin，别名白杨素，是广泛存在于蜂蜜、蜂胶以及多种植物提取物中的一个黄酮类物质。在以杨树为主要胶源植物的中国蜂胶中，柯因的含量较高，是中国蜂胶中黄酮类物质的一个典型组分[1]。研究表明：柯因具有广泛的生物学活性，如抗炎症[2]、抗肿瘤[3]、抗过敏、抗氧化[4]、免疫调节等[5]，对多种器官如肝脏[6]、肾脏[7]、结肠[8]具有保护效应，对慢性疾病如糖尿病[9,10]、心血管疾病[11]也有一定的正面作用。尤其是在多种肝脏疾病中，如化学毒物、高脂日粮和抗肿瘤药物所诱发的一系列肝脏损伤中，柯因都表现出显著的肝保护效果，体内和体外的实验结果还表明：柯因对肝脏肿瘤也有一定的抑制作用。由于柯因在多种植物来源的提取物中都具有较高含量，可作为安全的膳食补充剂和草药制剂使用，因此在保健、预防和治疗肝脏疾病上具有广泛的应用前景。

1 柯因在化学毒性物质诱发的肝脏损伤中的保护作用

目前，全世界范围内有数百万人遭受由化学物质所导致的肝脏损伤，如四氯化碳、D-半乳糖胺（D-GalN）、四氯二苯并-p-二恶英（TCDD）、对乙酰氨基酚、亚硝胺和多环芳烃等，这些化学物均能对肝脏产生显著的破坏作用。

1.1 四氯化碳（CCl4）

肝脏是机体代谢多种有害异物的首要器官。CCl4（一种工业溶剂、清洁剂和脱脂剂）可导致肝脏一系列进行性的病理变化，从引发炎症开始，到肝脏坏死、肝纤维化，直至肝硬化[12]，目前被广泛用于诱导外源性毒物引起的肝脏损伤模型。

1.1.1 柯因调节机体抗氧化水平——缓解氧化应激

肝脏中，在细胞色素P450 2E1的作用下，CCl4迅速转化为高反应性的三氯甲基自由基，CCl4的直接毒性作用被认为是由于其诱导产生的自由基而引发氧化应激、导致脂质过氧化，从而使肝脏功能受损[13]。在雄性SD大鼠上通过腹腔注射CCl4可诱导肝损伤，研究表明[14]：富含柯因的姜科植物益智的乙醇提取物及二氯甲烷提取物具有同西利马林（公认的具有肝保护作用的黄酮）相似的肝保护效应，能够显著降低血清中天门冬氨酸转氨酶（AST）、丙氨酸转氨酶（ALT）、碱性磷酸酶（ALP）以及总胆红素的水平。在这种肝保护作用中，清除自由基、抑制活性氧（ROS）的产生和脂质过氧化、增加抗氧化活性，对于缓解CCl4所诱导的氧化应激起着重要的作用。进一步的研究发现，在此过程中Nrf2（nuclear factor E2-related factor 2）路径的激活至关重要。转录因子Nrf2能够诱导对ROS和毒物发挥解毒活性的相关酶基因的表达[15]，从而保护组织免受ROS和毒物的损伤。富含柯因的提取物通过提高肝组织中Nrf2相关蛋白的表达，从而提高机体的抗氧化水平。

1.1.2 柯因抑制炎症——减少促炎症细胞因子的释放

在CCl4的作用机理上，已有的研究表明：急性的炎症使活化的枯否氏细胞（即肝巨噬细胞）释放细胞因子，而这正是肝脏损伤的一个关键事件。CCl4在肝脏中所产生的氧化应激，会促使多种促炎症因子如肿瘤坏死因子α（TNF-α）、环氧酶2（COX-2）和白介素6（IL-6）的释放[16]，从而发动炎症反应，且伴有细胞凋亡的增加[17]。在这一过程中，TNF-α是枯否氏细胞合成的一个主要的促炎症蛋白[18]，由其引发了介导炎症反应的、细胞因子的级联放大过程。

Hermenean等[19]在雄性CD-1小鼠上的研究表明：在腹腔注射CCl4诱导急性肝损伤之前，对小鼠进行为期1周的柯因灌胃预处理（50 mg/kg），在血清学指标上可以降低其中反映肝功能的两个指标AST和ALT的水平；在组织学上，可显著改善CCl4所引起的小叶中心坏死、脂肪变性以及肝细胞亚显微结构异常；同时，柯因预处理还导致肝脏中促炎症细胞因子TNF-α和α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）表达显著下降，其效果与同剂量的西利马林的作用相当。进一步的研究发现，柯因主要是通过与TNF-α转化酶（TACE，一种锌内肽酶）形成复合物从而调节TNF-α前体的加工、减少可溶性TNF-α的释放，从而缓解炎症。

1.1.3 柯因抑制肝纤维化——抑制肝星状细胞的活化及细胞因子的产生

CCl4导致的慢性肝脏损伤还可继续演变为肝纤维化。在此过程中，肝星状细胞（HSCs）的活化与肝纤维化的发生有着紧密联系。肝损伤时，HSCs活化，随后释放细胞因子和趋化因子，由此诱导了其向肌成纤维细胞样细胞的分化转化。这一过程是以α-SMA以及原胶原-1的出现为特征的，最终导致了细胞外基质（ECM）组分以及胶原的产生及累积，从而导致肝纤维化[20]。在肝纤维化的病理发生过程中，转化生长因子TGF-β——肝脏中主要的致纤维因子（细胞因子的一种），被认为是HSCs的关键激活因素。TGF-β同时直接或间接作用于不同类型的肝细胞，一方面TGF-β作用于HSCs使其向肌成纤维细胞分化，并且产生ECM；另一方面，肝细胞也对TGF-β做出响应，导致肝细胞的凋亡，并且对肝细胞的再生过程进行控制。在HSCs中，TGF-β通过活化Smad信号途径而起作用[21]。TGF-β可促进Smads2和Smads3这两个蛋白的表达，激活HSCs中胶原的转录合成，上调ECM相关蛋白的合成等[22]。

Balta等[23]在雄性CD1小鼠上的研究发现，柯因对CCl4所造成的慢性肝损伤具有显著保护作用。柯因处理（50～200 mg/kg）可以显著降低肝纤维化的程度，减少因CCl4激活HSCs所诱导的α-SMA的表达，显著下调细胞因子TGF-β的水平；同时，肝脏中Smad2、Smad3 mRNA的表达水平显著下降，从而逆转由CCl4所诱导的肝纤维化，其效果与相同剂量（200 mg/kg）的肝保护黄酮西利马林的效果相当；说明柯因的肝保护机制主要是通过TGF-β/Smad 途径抑制HSCs的活化及其增殖。

肝脏纤维化的过程是可逆的，而肝硬化——肝纤维化发展的最终阶段通常是不可逆的。柯因作为一种能有效地抗纤维变性的天然黄酮，可以阻止、减缓或者逆转肝纤维化的进程，因此，在肝纤维化的治疗上具有潜在的应用前景。

1.2 D-半乳糖胺（D-GalN）

D-GalN所诱导肝损伤，与临床上病毒性肝炎的肝脏病理变化非常类似，其与脂多糖组合被经常用于产生与病毒、药物或酒精诱导、免疫诱导、剂量缺血再灌注肝炎有关的亚致死性肝功能衰竭[24]。一开始认为：D-GalN进入体内后，在肝细胞中高浓度的半乳糖激酶以及 UDP-葡萄糖：半乳糖-1-尿苷酰转移酶的作用下，体内生成大量的UDP-D-GalN衍生物，导致尿苷磷酸酯库的耗竭，从而抑制依赖于尿苷酸核苷酸的生物合成过程，抑制mRNA和蛋白质合成[25]，进而导致细胞膜通透性的改变以及之后细胞内酶的渗漏。后续的研究逐渐发现ROS在D-GalN所诱导的肝损伤中也有重要作用[26]。

1.2.1 柯因具有抗高血脂作用——优化血清指标

Pushpavalli等[27]在雄性白化Wistar大鼠上通过腹腔注射D-GalN诱导肝脏损伤，同时对大鼠进行灌胃柯因处理（25 mg/kg），其结果表明：柯因处理可使反映肝功能的多个指标如AST、ALT、ALP以及γ-谷氨酰转肽酶（γ-GT）均有所下降，同时还降低血浆中的总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、游离脂肪酸的水平，降低极低密度脂蛋白胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇的水平，而增加高密度脂蛋白胆固醇，优化多项血清指标，表现出显著的肝保护效应及抗高血脂活性，且其保护效应与保肝药西利马林相当。

1.2.2 柯因具有抗氧化作用

针对D-GalN所诱导肝损伤，Pushpavalli等[28]在雄性白化Wistar大鼠上对其进行20 mg/kg体重的柯因灌胃处理，结果显示：柯因可以显著降低大鼠肝功能标志酶的活性，降低脂质过氧化产物如减少与硫代巴比妥酸反应的物质（TBARS）、脂质过氧化氢和共轭二烯的产生；增加了自由基清除酶如超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）的活性，同时也增加了非酶抗氧化类物质如还原型谷胱甘肽、Vc、VE的含量；说明柯因可通过提高机体的抗氧化水平对D-GalN所诱导的肝损伤发挥其肝保护功能。

1.3 四氯二苯并-p-二恶英（TCDD）

TCDD是广泛存在于环境（如除草剂）中的一种污染物，可作用于人和实验动物，导致包括消耗综合征、肝脏毒性、免疫毒性、致畸、致突变以及致癌等一系列的毒性效应。其中，氧化应激是TCDD作用机制的一个重要部分。TCDD对肝脏的损害主要表现为：使丙二醛（MAD）水平上升促进脂质过氧化，降低谷胱甘肽的含量，降低抗氧化相关酶类CAT、GPx和SOD的水平，降低肝细胞膜的流动性。在组织学上表现出严重的损伤，如肝细胞体积显著增大、肝细胞中含有空泡、出现很多凋亡的肝细胞（与caspase-3反应呈阳性的细胞）等[29]。

Ciftci等研究表明[30]：TCDD在雄性白化Wistar大鼠上所诱导的肝组织形态的异常变化以及肝脏抗氧化酶活力的改变，可以通过柯因和槲皮素（一种黄酮物质）的联合使用而逆转。同时柯因可以降低肝脏MAD的水平，对TCCD诱导的脂质过氧化具有保护作用。此前，Ciftci等[31]的研究结果也显示：柯因处理（每天灌胃50 mg/kg）可显著缓解TCDD在大鼠上所导致的TBARS含量显著上升、细胞因子TNF-α水平显著升高以及干扰素γ（IFN-γ）的水平显著下降等负面效应。这些结果说明柯因可以通过调节机体的抗氧化水平，减少炎症相关细胞因子的分泌，从而缓解TCDD所诱导的肝组织损伤。

1.4 酒精（乙醇）

酒精性肝病是全世界范围内一种常见的慢性肝病。长期摄入酒精会导致一系列严重疾病，包括酒精性脂肪肝、高甘油三酯血症、肝硬化、心血管疾病和胰腺炎症等[32]。乙醇是一种脂溶性非电解质，经由胃肠道吸收后扩散入血液，进而分布于全身。乙醇在体内的氧化分解主要经乙醇脱氢酶（ADH）代谢为乙醛，乙醇还可被微粒体乙醇氧化系统（MEOS）以及过氧化酶体中的过氧化氢酶作用生成乙醛，乙醛再经乙醛脱氢酶（ALDH）氧化为乙酸[33]。乙醇在这三条代谢路径中所产生的乙醛均可导致自由基的产生，从而诱导肝脏损伤[34]。此外，乙醛还可与蛋白质、核酸等大分子互作，形成加合物。体内外的实验结果均显示，乙醛具有直接的致突变和致癌作用，可在人淋巴细胞上导致点突变，诱导姐妹染色单体交换及染色体异常[35]。

研究表明[36]，乙醇的摄入会破坏机体促氧化（pro-oxidant）和抗氧化（anti-oxidant）能力之间的微妙平衡，诱导更多自由基（羟乙基自由基、超氧化物自由基、羟基自由基、过氧化氢自由基等）的产生从而引起氧化应激，而这些自由基亦可诱导脂质过氧化，从而使肝细胞膜被破坏、细胞受损。此外，乙醇诱导产生的ROS和活性氮（RNS）还可通过激活巨噬细胞（枯否氏细胞）、促进促炎症因子（如TNF-α、白细胞介素IL-1B、IL-6）的释放诱导肝脏炎症导致肝损伤[37]。

氧化应激在乙醇诱导肝损伤的病理中是重要的一环。Sathiavelu等[38]在乙醇诱导所致肝损伤的雌性Wistar大鼠上的研究表明：柯因灌胃处理（20 mg/kg）可以显著降低TBARS含量，降低脂质过氧化物和共轭二烯的水平，显著提高肝脏组织中SOD、CAT、GPx、谷胱甘肽还原酶（GR）、谷胱甘肽-S-转移酶（GST）的活性以及还原型谷胱甘肽、VC及VE的水平，说明柯因对乙醇诱导产生的自由基所介导的氧化应激具有显著的保护作用。同时，组织学的结果也证实柯因对乙醇诱导的肝损伤具有明显的缓解作用。同样，Tahir和Sultana[39]在雄性Wistar大鼠上的研究也表明：柯因灌胃处理（20～40 mg/kg）可使乙醇所诱导的、肝脏组织中显著升高的ADH、CYP 2E1（MEOS中将乙醇代谢为乙醛的一个重要酶）以及另一肝脏氧化损伤指标——黄嘌呤氧化酶（XO）的活性恢复至正常大鼠水平，使乙醇所致枯竭的、与谷胱甘肽有关的肝脏氧化应激指标（GSH、GD、GR）及CAT也恢复至正常水平。这些研究均表明：柯因是一种有效的自由基清除剂和氧化应激抑制剂，可以抑制乙醇代谢相关的酶的活性，增强肝脏抗氧化相关的酶水平，在缓解乙醇所致的肝损伤上具有显著的肝保护作用。

2 柯因在由抗肿瘤药物所引发的肝损伤中的作用

2.1 氨甲蝶呤（MTX）

MTX是一种叶酸拮抗剂，能抑制二氢叶酸还原酶的活性，从而干扰核酸的生物合成，在一系列肿瘤和自身免疫性疾病的治疗中是被广泛使用的、有效的化疗药物。然而，氨甲蝶呤对组织器官（如肝、肾、胃肠道、神经等）的毒性作用限制了其临床上的使用，其中，肝脏毒性是其主要的副作用[40]。目前，一种理论认为MTX诱导肝损伤主要是因为细胞中的MTX以聚谷氨酸盐的形式积聚，导致了叶酸的耗竭，从而导致肝损伤。还有理论则认为MTX通过降低肝细胞的抗氧化防御能力使其对ROS更为敏感，而ROS介导的脂质过氧化破坏了肝细胞膜的结构，影响了细胞的正常功能，ROS还可导致DNA损伤，从而促使细胞凋亡[41]。由于MTX无法区分正常细胞和肿瘤细胞，使得正常肝细胞也走向凋亡，导致肝损伤的发生。

许多研究已经证实，在MTX诱导的多器官损伤，特别是肝损伤中，氧化应激起了主要作用，而具有抗氧化活性的柯因可以显著降低诸多肝脏氧化应激标志物的水平，减轻MTX在肝组织中引起的病理学变化，抑制细胞凋亡，从而对肝脏起到保护作用。Ali等[42]在雄性Wistar大鼠上的研究表明，柯因能够显著降低血清中ALT、AST、乳酸脱氢酶（LDH）的活性，显著降低MAD的含量，升高与肝脏抗氧化能力密切相关的GPx、GR、SOD、CAT以及谷胱甘肽的含量，恢复、提高肝细胞的抗氧化防御能力。组织病理学观察结果发现：柯因处理可显著缓解MTX所导致的肝细胞异常、变形，同时，柯因还可下调与细胞凋亡密切相关的蛋白，如转录因子p53、促细胞凋亡蛋白BcL-2家族成员Bax蛋白以及半胱氨酸蛋白酶3（caspase-3）的表达，从而抑制细胞凋亡。

2.2 顺氯氨铂（顺铂）

顺铂是一种有效的、被广泛使用的化疗药物，用于治疗多种恶性肿瘤，但顺铂的治疗作用因其具有剂量依赖的肝肾毒性而受到限制。其中，顺铂诱导的肝毒性与肝脏氧化应激和炎症密切相关。

Rehman等[43]在雄性Wistar大鼠上的研究结果显示，由腹腔注射顺铂所导致的肝脏损伤，可以通过对大鼠进行灌胃柯因（25～50 mg/kg）预处理来缓解。柯因能够缓解肝脏脂质过氧化，降低黄嘌呤氧化酶XO的活性，改善肝脏谷胱甘肽的耗竭，提高多种抗氧化相关酶（如CAT、GR、GPx、SOD）的活性，并增加II相解毒酶（如谷胱甘肽-S-转移酶和醌还原酶）的活性；同时柯因还下调了COX-2的表达以及损伤后被诱导表达的、诱导型一氧化氮合酶（iNOS）的表达，降低了细胞因子NF-κB、TNF-α的水平，并在组织学上缓解顺铂诱导的肝组织损伤。因此，柯因可以通过减轻氧化应激和炎症响应来缓解顺铂对肝脏的毒性作用。

3 柯因在由高脂日粮所引发的肝损伤中的作用

由巨噬细胞发动的炎症是机体防御有害刺激的一种保护性生理反应，然而，持续的炎症导致组织损伤和坏死，从而引起一系列疾病，甚至是癌的发生[44]。已知巨噬细胞可以通过极化分型对不同微环境下的炎症平衡进行调节。巨噬细胞的极化分型按照其功能分为两个亚群（M1型和M2型），以分泌促炎因子为主、发挥促炎功能的巨噬细胞称为M1型巨噬细胞，而以发挥降低炎症反应、发挥组织修复功能为主的巨噬细胞称为M2型巨噬细胞[45]。因此，基于巨噬细胞M1/M2比例的调控可能是消灭炎症、筛选药物的新途径。

在小鼠和大鼠上的研究都表明：高脂日粮可导致肝脏炎症的发生[46-48]。高脂日粮一方面可使肝脏中出现不同程度的脂肪变性，肝细胞结构异常，小叶中心的肝细胞受到严重影响，肝细胞中含有大小不等的脂滴；另一方面，还导致肝脏炎症反应，主要表现为巨噬细胞在肝脏的浸润。Feng等[49]在雄性C57BL/6J小鼠上的研究显示，对饲喂高脂日粮的小鼠进行腹腔注射柯因处理（25～30 mg/kg），不仅可以减轻高脂日粮所诱导的肝脏脂肪变性（抑制脂滴的出现），降低血清AST和ALT水平，而且可以显著减轻肝脏炎症。柯因显著地抑制了单核细胞向成熟巨噬细胞的分化，减少了巨噬细胞在肝脏和脂肪组织中的浸润，并且在体内和体外实验中均可诱导巨噬细胞抗炎症的M2表型而降低促炎症的M1表型。进一步的研究发现：柯因对巨噬细胞极化状态（M1/M2）的调控离不开过氧化物酶体增殖体激活受体γ（PPARγ），柯因通过转录激活PPARγ抑制很多促炎症基因的表达（如NO合成酶、NF-κB和环氧酶），从而发挥其抗炎症和免疫调节的作用。

4 柯因在治疗肝脏肿瘤中的积极作用

肝脏肿瘤是全世界范围内的常发性肿瘤，其中，由肝脏肿瘤引发的死亡人数在东亚地区（尤其是中国）是最高的，约占总数的50%[50]。尽管通过手术治疗、肝脏移植以及化疗等多种手段可以延长肝癌患者的生存年限，但肿瘤的复发以及耐药性的问题仍使肝癌的致死率居高不下[51]。根据肿瘤干细胞假说，肿瘤中存在的、能够耐受化疗的肿瘤干细胞（CSCs）促使了肿瘤的复发[52]。这些肿瘤干细胞是预防和治疗肿瘤的有效靶标，然而，目前针对肝脏肿瘤的化疗或放疗措施均无法有效杀死这些肿瘤干细胞，最终导致了肿瘤的复发及转移。在肿瘤发生机制上，目前已知干细胞激活剂，如Wnt/β-连环蛋白（β-catenin）和转化生长因子TGF-β、Notch及Hedgehog信号途径都可加速肿瘤的发生[53]。已有的研究表明柯因具有抗肿瘤活性，在抑制肿瘤细胞的再生以及诱导肿瘤细胞凋亡方面效果显著。

4.1 柯因作用于肿瘤干细胞

Quan等[54]在肝脏肿瘤干细胞（LCSCs）上的研究表明：Wnt3a蛋白可以诱导β-catenin稳定，从而使LCSCs中β-catenin的浓度上升，而8-溴-7-甲氧基白杨素（BrMC），一种合成的柯因类似物，能够降低LCSCs中β-catenin的表达，优先抑制LCSCs的增殖和自我更新，显著抑制上皮细胞间质转型EMT（epithelial-mesenchymal transition）以及LCSCs的入侵，并能有效清除LCSCs。Zou等[55]的研究结果显示：来自人肝癌细胞系SMMC-7721的球形成细胞（SFCs）具有肝脏肿瘤干细胞的特性，目前肝细胞癌的临床用治疗药物——索拉非尼，能够降低其自我更新的能力，下调干细胞标志物（如CD133、CD44和ALDH1）的表达。BrMC与索拉非尼联合使用，不仅可表现出正协同效应，而且可显著降低干细胞的迁移和入侵、下调N-钙粘蛋白（与癌细胞的侵袭与转移有关）、上调E-钙粘蛋白（抑癌基因CDH1的表达产物），促进细胞凋亡；且BrMC与索拉非尼对肿瘤干细胞的协同抑制效应是通过下调转录因子HIF-1α和上皮细胞间质转型EMT的调控物Twist1来实现的；这一研究结果和之前Ren等[56]的结果相一致。

4.2 柯因促使肿瘤细胞凋亡

柯因还具有促进肝脏肿瘤细胞凋亡的活性[57]。例如，Li等[58]认为柯因能够使肿瘤细胞对TNF-α诱导的细胞凋亡更加敏感。Huang等[59]的研究发现：柯因和芹黄素（4',5,7-三羟基黄酮）的联合使用，可以降低人肝癌细胞HepG2的活力、抑制其增殖，诱导细胞凋亡，并且指出其作用机制是通过下调肝脏肿瘤中过表达的两个蛋白：细胞S期激酶相关蛋白2（Skp2）和低密度脂蛋白受体相关蛋白6（LRP6）的表达来介导的。同样，Li等的研究结果显示[60]：柯因与顺铂的联合使用可以促进HepG2细胞的凋亡，且这种作用是通过上调与细胞凋亡密切相关的转录因子p53蛋白实现的，即通过激活HepG2中的细胞外调节蛋白激酶ERK1/2促使p53的磷酸化及积累，从而导致BcL-2家族成员中促细胞凋亡蛋白Bax的过表达以及死亡受体DR5蛋白的过表达，而抑制BcL-2家族成员中抗细胞凋亡蛋白的表达。Yang等[61]的研究结果则显示：BrMC可通过增加ROS的产生促进肝脏肿瘤细胞（HepG2、Bel-7402以及L-02）的凋亡。Zhang等[62]的研究结果也表明：富含柯因的益智石油醚提取物作用于人肝癌HepG2细胞，可促进LDH的释放、扰乱线粒体膜电位、增加细胞内ROS、诱导HepG2细胞的凋亡，其机制是通过增加Bax/Bcl-2的比率、活化caspase-3/9促进细胞凋亡。这些结果提示，在对肿瘤细胞凋亡的调节上，柯因与不同物质的组合，其调节方式可能具有双向性，在与抗肿瘤药物联合使用对抗其负面效应时表现出抑制正常细胞凋亡的特性，而与化疗药物同时使用或单独使用时，可以防止肿瘤细胞对药物的抗性，在肿瘤细胞中表现出促进细胞凋亡的作用特点。

在体内实验中，柯因同样表现出显著的促肿瘤细胞凋亡活性。Khan等[63]在雄性Wistar大鼠上利用二乙基亚硝胺（DEN）诱导肝癌发生后，对其进行柯因（250 mg/kg）灌胃处理。其结果显示，柯因显著减少了结节的数量和大小；血清中AST、ALT、ALP、LDH和γGT的活性显著降低；COX-2、NF-κB及p65的mRNA及蛋白水平均显著下降，而与细胞凋亡过程密切相关的p53、Bax和caspase3的mRNA及蛋白水平则显著上升；同时β-抑制蛋白（β-arrestin）和抗凋亡的标志物Bcl-xL的水平下降，说明柯因具有全面的肝保护作用，且其作用主要是通过p53介导的细胞凋亡。同样，柯因的甲基化衍生物——二甲氧基黄酮（DMF），在雄性Wistar大鼠上（100 mg/kg）也可显著抑制DEN所诱导的癌前病变，其机制与抑制Wnt路径以及NF-κB所介导的炎症反应有关[64]。

4.3 柯因的其他抑癌作用机制

肿瘤干细胞存在多种致病机制，维持肿瘤干细胞生存的因素，如血管发生与生成、入侵与迁移、组织低氧、免疫逃避、多种药物及放射耐受性等，都与其活性有关。Zhao等[65]的研究显示，柯因是云南栘中的一种主要黄酮物质，在体外试验中，柯因表现出对多种培养的肿瘤细胞（包括人Huh7肝肿瘤细胞系）都具有显著的细胞毒性作用；在体内实验中，通过皮下注射肝腹水瘤H22细胞在昆明鼠上诱导移植性肿瘤，柯因不仅通过活化caspase-3诱导细胞凋亡，而且还抑制血管内皮生长因子（VEGF）的产生、抑制血管生成，从而发挥抗肿瘤的活性。

肿瘤细胞对化疗药物的耐药性一直是导致化疗策略失败的主要原因，理论上联合用药可促进药物同时作用于多个细胞过程，干扰其耐药机制，从而对抗肿瘤的生长和发展。柯因对肿瘤细胞的显著毒性以及其对正常细胞不具有毒性作用的特点使其成为与抗肿瘤药物联合使用的首选。

5 结论

体内外的实验证明：在多种肝脏损伤形式中，柯因具有优化血清指标、恢复肝组织的正常结构、缓解肝脏的氧化应激、抑制促炎症细胞因子的释放、缓解炎症等显著的肝保护效应，同时，柯因能使肿瘤细胞对药物更敏感或直接杀伤肿瘤细胞，促进肝脏肿瘤细胞凋亡。随着对柯因肝脏保护功能作用机制研究的深入，联合应用多种含有柯因的天然植物提取物及其他对肝脏具有保护、治疗效果的药物将是未来治疗各种肝脏疾病、防治肝脏肿瘤的一个主要研究方向。柯因是蜂胶黄酮的一个主要组分，作为一种可食用的黄酮，其广泛的生物来源也使其成为一种具有潜力的新药开发来源，拥有广阔的应用前景。

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