超临界CO2萃取甲鱼油工艺研究

赵淑静，汪有先，何 云，包建强(上海海洋大学 食品学院，上海水产品加工及贮藏工程技术研究中心，上海201306)

甲鱼隶属鳖科，又名中华鳖、王八[1]。甲鱼全身都是宝，不同部位具有不同的保健功能[2]，医疗保健能效更是早在3 000多年前的《神农本草经》中就有记载[3]。据研究表明，鱼油中的ω-3系多不饱和脂肪酸(PUFA)颇为丰富[4]。甲鱼油中不仅含有较多的锌、铁等微量元素[5]，还含有丰富的不饱和脂肪酸：亚麻酸、亚油酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA) 。由于甲鱼油脂肪酸不饱和程度极高，其具有健脑明目、保护视网膜、促进胆固醇的代谢、降压降脂、抗炎消肿、提高免疫力、延缓衰老等药食兼用的特殊功效[6]，所以添加了甲鱼油的保健品一直备受人们青睐。

目前，对甲鱼油的研究并不多，关于甲鱼油的文献也比较少，但随着养殖技术的成熟，养殖模式的改进，全球甲鱼养殖产量呈直线上升的趋势，从2005年的14万t增长到2014年的34.1万t[7]，加工过程中出现的副产物也随之增多。据报道，每加工1万t鱼可得到0.2万t鱼骨、肉、内脏等废弃物，可以从中提取200 t鱼油。

关于鱼油的提取方法目前常用的有酶解法[8]、淡碱水解法[9]、超临界CO2萃取法[10]等，其中酶解法和淡碱水解法提取的鱼油不仅质量会受到有机溶剂的影响，还存在污染环境等问题，而超临界CO2萃取法是具有“绿色”特性的提取方法。Ferdosh等[11]采用超临界CO2萃取金枪鱼鱼头中的油脂，发现ω-3 PUFA占总脂肪的22.30%。甲鱼油类似鱼油，可以参照鱼油的提取方法。本文以甲鱼四肢根部脂肪为原料，选择超临界CO2萃取法萃取甲鱼油，通过正交试验确定甲鱼油萃取的最佳工艺参数，并对甲鱼油的基本理化性质和脂肪酸组成进行分析，可为甲鱼下脚料的综合开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

甲鱼四肢根部的黄色脂肪块(宁波明凤渔业有限公司)。原料脂肪解冻绞碎之后每25 g封装于塑料自封袋中，于-50℃储存备用。

CO2(纯度>99.9%)，食品级，上海利旦工业气体有限公司；Supelco 脂肪酸甲酯混标(纯度>99%)；甲醇、正己烷为色谱纯；氢氧化钠、无水乙醇、无水硫酸钠、无水乙醚、冰乙酸、碘化钾、淀粉、韦氏试剂、酚酞、磷酸等，均为分析纯。

Speed SFE-2超临界萃取仪，美国 Applied Separations公司；H1850R高速冷冻离心机；R250B旋转蒸发仪；Agilent 6890N-5975C气相色谱仪，安捷伦科技有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 甲鱼油萃取工艺

称取新鲜甲鱼脂肪块25 g左右放入50 mL萃取釜中，打开冷凝系统使温度降到5℃，检查设备的气密性，设定萃取温度和出口阀温度，打开CO2、N2储气罐阀门，设定萃取压力，静态萃取10 min，打开出口阀收集萃取的甲鱼油，同时在出气阀处放置氮吹仪，减少甲鱼油与空气的接触。精确称量甲鱼油质量，计算萃取率。萃取率=甲鱼油质量/原料中脂肪质量×100%。

由于设备的限制，CO2流量控制在1.6 kg/(h·g)，且最大萃取压力不能超过45 MPa。

1.2.2 甲鱼脂肪块基本成分的测定

采用105℃烘箱干燥法测定水分含量，具体参照GB 5009.3—2016；采用索氏抽提法测定粗脂肪含量，具体参照GB 5009.6—2016；采用高温灼烧法测定灰分含量，具体参照GB 5009.4—2016。

1.2.3 甲鱼油理化性质测定

过氧化值：参照 GB 5009.227—2016；酸值：参照 GB 5009.229—2016；碘值：参照GB/T 5532—2008 (韦氏法)；水分及挥发物：参照GB 5009.236—2016。

1.2.4 甲鱼油脂肪酸组成分析

样品甲酯化[12]：取甲鱼油0.1 g，加5 mL 0.5 mol/L 氢氧化钠甲醇溶液、100 μL内标(10 mg/mL十九烷酸氯仿溶液)于圆底烧瓶中，100℃水浴中加热回流10 min，直至无油滴，然后加3 mL三氟化硼甲醇溶液反应5～10 min，最后加入2 mL正己烷冷凝回流2 min，取出冷凝装置将回流瓶冷却至室温后加10 mL饱和氯化钠溶液混合并将其移入具塞试管中，反复冲洗回流瓶3次，将洗液一并倒入具塞试管中静置，加入5 mL饱和NaCl溶液混合。待分层后吸取上层溶液用 0.22 μm 微孔过滤膜过滤后，于4℃下保存，待气相色谱分析。

气相色谱条件：色谱柱为SP-2560毛细管柱(100 m×0.25 mm×0.2 μm)，柱流量1.0 mL/min；初温70℃，以50℃/min的速率升高到140℃，再以4℃/min的速率升高到180℃，最后以3℃/min的速率升高到225℃；载气为高纯氮气(纯度99.99%)；进样口温度250℃；分流比45∶1；进样量1 μL。

2 结果与分析

2.1 甲鱼脂肪块基本成分(见表1)

表1 甲鱼脂肪块基本成分 %

由表1可知，甲鱼四肢根部脂肪块中粗脂肪含量高达86.66%，可作为甲鱼油提取的良好原料。

2.2 超临界CO2萃取甲鱼油单因素试验

2.2.1 萃取压力对甲鱼油萃取率的影响

在萃取温度50℃、萃取时间 5 h的条件下，不同萃取压力条件下甲鱼油的萃取率变化如图1所示。

图1 萃取压力对甲鱼油萃取率的影响

由图1可知，在选定的萃取压力范围内，随着萃取压力的增加，甲鱼油的萃取率逐渐增加。这是因为压力改变了CO2的密度及溶解能力[13]，致使甲鱼油的萃取率随萃取压力持续增加，但当萃取压力增加到一定程度时，CO2对溶质的溶解能力增加缓慢，继续增压不仅达不到预期的效果，可能反而会降低溶解性，且由于设备的限制，不能超过45 MPa。故萃取压力选为 35～45 MPa。

2.2.2 萃取温度对甲鱼油萃取率的影响

在萃取压力40 MPa、萃取时间5 h的条件下，不同萃取温度条件下甲鱼油萃取率变化如图2所示。

由图2可知，当萃取温度在45～50℃时，甲鱼油萃取率随着萃取温度的升高而增加，而在50～60℃范围内时，随着萃取温度的升高，萃取率逐渐降低。这可能是因为温度过高降低了超临界流体的密度，使物质的溶解度降低而不利于萃取[14]。 为了保护甲鱼油的生物活性物质，不易采用太高的温度。故萃取温度选为45～55℃。

2.2.3 萃取时间对甲鱼油萃取率的影响

在萃取温度50℃、萃取压力40 MPa条件下，不同萃取时间条件下甲鱼油萃取率变化如图3所示。

图3 萃取时间对甲鱼油萃取率的影响

由图3可知，在选定的萃取时间范围内，萃取率随着萃取时间的延长而增加，但当萃取时间达到5 h后，萃取率增加曲线趋于平缓。综合考虑，萃取时间选为4～6 h。

2.3 超临界CO2萃取甲鱼油正交试验

根据单因素试验结果，选取萃取压力(A)、萃取温度(B)、萃取时间(C)作为正交试验因素，以甲鱼油萃取率为指标，采用 L9(34)正交试验设计，正交试验因素水平编码见表2，正交试验方案及结果见表3。

表2 正交试验因素水平编码

表3 正交试验方案及结果

由表3可知，超临界CO2萃取甲鱼油过程中，各因素对萃取率影响大小依次为：萃取温度>萃取压力>萃取时间，即萃取温度对甲鱼油的萃取率影响最大，萃取压力次之，萃取时间最小。得到超临界CO2萃取甲鱼油的最佳工艺条件为A3B3C2，即萃取温度55℃、萃取压力45 MPa、萃取时间5 h。在最佳条件下得到甲鱼油萃取率为96.42%，比酶解法[8]高出了26.37%。

2.4 甲鱼油的理化性质(见表4)

由表4可知，在最佳条件下超临界CO2萃取法得到的甲鱼油外观呈浅黄色，澄清透明，稍有鱼腥味，各项指标均达到粗鱼油行业一级标准，达到保健食品的要求。

表4 甲鱼油的理化性质

2.5 甲鱼油的脂肪酸组成

对萃取的甲鱼油进行气相色谱分析，测定其脂肪酸组成，结果见表5。

表5 甲鱼油的脂肪酸组成 %

由表5可知，甲鱼油共测出33种脂肪酸，单不饱和脂肪酸所占比例最高的是油酸，多不饱和脂肪酸以亚油酸为主，其中DHA和EPA总量达到了10.94%，且测得的油酸、EPA等的含量同陶轶松[8]、韩玉谦[15]等测定结果相近。研究发现，富含ω-3 PUFA的鱼油对降低兔子血中的胆固醇有明显的效果[16]，因此及时补充含有ω-3 PUFA的鱼油对人体健康有很大的益处[17]。

3 结 论

(1)采用单因素试验结合正交试验对甲鱼油的超临界CO2萃取工艺进行优化，得到最佳工艺条件为萃取压力45 MPa、萃取温度55℃、萃取时间5 h。在最佳工艺条件下，甲鱼油萃取率为96.42%。

(2)采用超临界CO2萃取技术得到的甲鱼油品质较好，各项指标均达到了粗鱼油行业一级标准，外观呈浅黄色，澄清透明，具有轻微鱼腥味；整个过程不使用有机溶剂，安全性高。

(3)采用超临界CO2萃取法得到的甲鱼油中含33种脂肪酸，不饱和脂肪酸含量达到79.97%，含有人体必需脂肪酸α-亚麻酸、亚油酸。其中单不饱和脂肪酸含量为49.85%，多不饱和脂肪酸含量为30.12%，DHA和EPA总量为10.94%。

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