Exendin-4对胰岛素抵抗人肝癌HepG2细胞脂代谢相关因子基因表达的影响

苏 寒，张美家，王怀杰，李 娜，霍连广，李桂芝，戴 功，高志芹，杨晓云1,，曲梅花

(1.潍坊医学院山东省高校应用药理学重点实验室，山东 潍坊 261053; 2. 潍坊医学院药学院药理学教研室，山东 潍坊 261053；3. 潍坊医学院临床医学院生物化学教研室，山东 潍坊 261053；4. 潍坊医学院生物科学与技术学院细胞生物学教研室，山东 潍坊 261053)

Exendin-4(Ex-4)是从墨西哥巨型蜥蜴的唾液中分离得到的一种氨基酸多肽，可促进胰岛素分泌[1]，改善胰岛素抵抗(insulin resistance, IR)。Ex-4具有稳定性好、半衰期长的优点，现已在临床用于治疗2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)，其治疗机制仍未完全阐明[2]。IR与多种疾病的发生有关，其中主要包括T2DM，如何改善IR是寻求治疗T2DM及其他代谢疾病的一个重要途径[3-4]。有研究[5]表明：IR在T2DM中更为普遍，导致了T2DM脂代谢的紊乱。乙酰辅酶A羧化酶(acetyl-CoA carboxylase，ACC)、脂肪酸合成酶(fatty acid synthase，FAS)、固醇调节元件结合蛋白1c(sterol regulatory element-binding protein-1c，SREBP-1c)和载脂蛋白B100(apolipoprotein B100，apoB100)是维持肝脏脂代谢的关键环节[6]。本研究通过建立HepG2细胞IR模型，研究Ex-4处理对IR细胞葡萄糖消耗、细胞内脂肪和甘油三酯(triglyceride,TG)的影响，以及对脂代谢相关因子ACC、FAS、SREBP-1c和 apoB100等表达的影响，阐明Ex-4对肝细胞脂代谢的作用机制。

1 材料与方法

1.1 细胞和主要试剂人肝癌HepG2细胞(中国科学院上海生命科学研究院细胞库)。DMEM培养基(美国Hyclone公司)，胎牛血清、胰酶、油红O、苏木素和牛胰岛素(北京索莱宝科技有限公司)，Ex-4(美国MedChemExpress公司)，甘油三酯检测试剂盒(南京建成生物工程研究所)，BCA蛋白定量试剂盒和Trizol(北京康为世纪生物科技有限公司)，SYBR Green PCR(日本TOYOBO公司)，PCR 引物(上海生工生物工程有限公司)，葡萄糖检测试剂盒(北京普利莱基因技术有限公司)。

1.2 HepG2细胞IR模型建立HepG2细胞按1∶3比例传代后，用含10%胎牛血清(FBS)的高糖DMEM培养基，在培养箱中37℃、5%CO2条件下进行培养，待到细胞长满80%左右，将细胞分为对照组和胰岛素组。待细胞培养12 h 后，对照组加入不含胰岛素的DMEM培养基，将李秀丽等[7]建立模型方法进行改进，胰岛素组分别加入含1×10-8、1×10-7、1×10-6和1×10-5mol·L-1胰岛素的培养基，继续培养24、36和48 h。处理后分别取出细胞培养基上清液，应用葡萄糖氧化酶法(GOD-POD)检测上清葡萄糖浓度，计算葡萄糖消耗量(mmol·L-1)。葡萄糖消耗量最低的一组即IR最佳模型组(葡萄糖消耗量=模型初始葡萄糖浓度-建模后葡萄糖浓度)。HepG2细胞建立IR模型(HepG2-IR细胞)后，然后将细胞分为对照组(不含胰岛素诱导)、IR组(IR模型，即HepG2-IR细胞)和Ex-4组(HepG2-IR细胞中加入10 nmol·L-1Ex-4)。

1.3 油红O染色在装有载玻片的6孔板中建立HepG2细胞IR模型(HepG2-IR细胞)，IR模型建成后分组同上。吸出培养基，用PBS清洗3次，4%多聚甲醛固定10 min，加入油红O工作液孵育10 min；细胞爬片破膜10 min，PBS漂洗3次，每次5 min，入油红O工作液37℃染色1～2 h。苏木素复染1～2 min，自来水冲洗，1%盐酸酒精分化数秒，自来水冲洗，氨水返蓝，流水冲洗。在显微镜下观察细胞中脂滴形成情况。用酶标仪测定各组细胞吸光度(A)值，计算细胞含脂率。细胞含脂率=(实验组A值-对照组A值)/对照组A值×100%。

1.4 TG 水平检测细胞分组同上。细胞长满约1×106mL-1时，将细胞用胰酶消化，离心留沉淀，PBS洗3次后再次离心，留沉淀； 加入少许裂解液进行裂解，取部分上清液检测TG水平。

1.5 实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法检测HepG2细胞中脂类代谢相关因子mRNA表达水平HepG2细胞建立IR模型后，分组同上。每个培养瓶中加入Trizol 1 mL，利用Trizol法提取细胞总RNA，RNA定量后进一步逆转录成cDNA。建立PCR反应体系，其中ACC、FAS、SREBP-1c和apoB100及GAPDH引物序列见表1，以GAPDH为内参基因。反应条件：预变性95℃、10 min，变性95℃、10 s，退火60℃、30 s，共40个循环；熔解曲线为：从55℃到95℃，每隔10 s 增加0.5℃。使用LightCycler®480实时荧光定量PCR系统上机扩增，得出实验数据，根据2-ΔΔCt计算各基因的相对表达水平。

表1 基因引物序列

2 结 果

2.1 IR模型建立在不同浓度胰岛素作用下，HepG2细胞在24、36和48 h时葡萄糖消耗量见表2。与对照组比较，胰岛素浓度为1×10-7mol·L-1作用36 h, HepG2葡萄糖消耗量最低，故本次实验中应用的胰岛素浓度为1×10-7mol·L-1、作用时间36 h为最佳造模条件。

2.2 各组细胞葡萄糖消耗量HepG2细胞诱导成IR形成后，采用GOD-POD法检测各组细胞葡萄糖消耗量，IR组(36 h, 胰岛素浓度为1×10-7mol·L-1)细胞葡萄糖消耗量[(1.656±0.133)mmol·L-1)]明显低于对照组[(1.845±0.138)mmol·L-1)](P<0.01)，说明IR模型已建立。

与IR组比较，Ex-4组细胞的葡萄糖消耗量 [(2.190±0.080)mmol·L-1)] 明显升高(P<0.05)。

2.3 各组细胞的形态表现及TG水平油红O染色结果显示：与对照组比较，IR组HepG2-IR细胞中红色脂滴明显增多；与IR组比较，Ex-4组细胞中红色脂滴明显减少(图1，见插页二)。与对照组(25%±6%)比较，IR组细胞含脂率(63%±12%)明显升高(P<0.05)；与IR组比较，Ex-4组细胞含脂率(34%±8%)明显降低(P<0.05)。各组细胞中TG水平(mmol·g-1)检测：与对照组(0.21±0.03)比较，IR组HepG2-IR细胞中TG水平(0.33±0.08)明显升高(P<0.05)；Ex-4组HepG2-IR细胞中TG水平(0.24±0.04)明显低于IR组(P<0.05)，接近对照组HepG2细胞中TG水平(P>0.05)，表明Ex-4通过调节TG的代谢影响细胞的脂质代谢途径，进而减少细胞内脂质的积聚。

表2 不同浓度胰岛素作用HepG2细胞24、36和48 h后葡萄糖消耗量

Tab.2 Glucose consumption of HepG2 cells treated with different concentrations of insulin for 24, 36 and 48 h

表2 不同浓度胰岛素作用HepG2细胞24、36和48 h后葡萄糖消耗量

GroupGlucoseconsumption(t/h) 243648Control1．645±0．0981．845±0．1382．148±0．143Insulin(mol·L-1) 1×10-81．723±0．147∗1．737±0．042∗2．148±0．182 1×10-71．703±0．067∗1．656±0．133∗1．879±0．127 1×10-61．834±0．183∗1．762±0．0532．012±0．129 1×10-52．034±0．108∗1．937±0．0672．388±0．157

*P<0.05 compared with control group at same time.

2.4 各组细胞中脂类代谢相关因子mRNA 表达水平与对照组比较，IR组HepG2-IR细胞中ACC、FAS和SREBP-1c mRNA表达水平明显升高(P<0.01)，apoB100 mRNA表达水平明显降低(P<0.05)；与IR组比较，Ex-4细胞中ACC、FAS和SREBP-1c mRNA表达水平明显降低(P<0.05)，apoB100 mRNA表达水平明显升高(P<0.01)。见表3。

表3 各组HepG2细胞中脂类代谢相关因子mRNA表达水平

*P<0.05，**P<0.01 compared with control group；△P<0.05，△△P<0.01 compared with IR group.

3 讨 论

胰高血糖素样肽1(glucagon-like peptide-1，GLP-1)是肠道分泌的一种肠促胰岛素[8]，能够刺激胰岛β细胞分化，改善细胞的胰岛素敏感性，降低血糖，但其半衰期较短，作为临床药物常受到制约[9-11]。作为第一个临床使用的GLP-1类似物药物，Ex-4的特点是可模拟人体内自然分泌的激素，调节血糖水平，且与GLP-1有相似的生物学作用，Ex-4具有半衰期长的优点，在研究中更具有优势[12-13]。

IR与脂代谢异常有密切关联，所以研究脂代谢的变化是寻找改善IR的一个重要途径。本文作者主要是通过观察Ex-4调节脂代谢的相关因子来探讨Ex-4对IR的影响。脂代谢相关因子ACC和FAS是脂肪酸合成限速酶[14]，ACC、FAS等因子表达水平明显增加，可引起肝脏内脂肪酸合成增加、积累，导致肝细胞脂代谢异常，从而进一步加重IR；FAS还在结合与转运脂质和调节脂蛋白代谢等方面具有重要作用，其表达水平的升高能够明显增加TG在体内的沉积从而使糖尿病的脂代谢紊乱[15-16]。本研究结果显示： IR形成后，脂肪酸合成增加，脂类物质聚集，ACC和FAS表达水平升高。

SREBP-1c是核转录因子，在脂肪酸的合成中发挥重要作用，SREBP-1c活性升高引起摄入游离脂肪酸增加[17]。本研究显示：HepG2-IR细胞经Ex-4处理后，SREBP-1c表达水平降低，提示Ex-4能够减少游离脂肪酸的生成，改善脂肪酸合成异常的现象，使脂肪酸合成减少。apoB100在肝脏中合成，是低密度脂蛋白的载脂蛋白，参与低密度脂蛋白的转运[18-19]。本研究结果显示：Ex-4处理HepG2-IR细胞后，apoB100 mRNA表达水平升高，说明Ex-4通过影响apoB100表达使其能够加剧游离脂肪酸的转运。

研究[20]表明：Ex-4可提高诱导的3T3-L1脂肪细胞IR模型的葡萄糖摄取量，从而改善脂肪细胞的IR。Ex-4在抑制人或动物体质量增长、促进胆固醇代谢和改善胰岛素敏感性方面具有重要作用，可防止高脂诱导的IR[21-22]。本研究结果显示：Ex-4能够增加 HepG2-IR细胞的葡萄糖消耗量，降低TG的水平，与上述文献报道一致。

综上所述，Ex-4可调节脂代谢的过程，改善脂肪酸合成异常，进而改善IR。本研究结果为Ex-4成为临床一线抗糖尿病药物提供了理论依据。

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