荞麦花叶发酵提取物对2型糖尿病db/db小鼠肾损伤的影响

王建行，姜 妍，王 妍，吴 磊，穆 玉，韩淑英

(1.华北理工大学冀唐学院医学实验中心，河北 唐山 063000；2.华北理工大学冀唐学院教学管理部，河北 唐山 063000；3.华北理工大学基础医学院药理学教研室，河北 唐山 063000； 4.河北省慢性疾病重点实验室及唐山市慢性病临床基础研究重点实验室，河北 唐山 063000)

糖尿病肾损伤是一种糖尿病病程中最常见且最严重的慢性并发症，是糖尿病全身性微血管病变表现之一，其以肾小球滤过率降低、肾小球外基质堆积和肾小球纤维化为主要病理特征[1]，持续发展可致终末期肾功能衰竭[2]。近年来随着糖尿病患者的增多，糖尿病肾损伤的发病率亦逐年上升，其发病机制尚不清楚。

前期研究[3-6]显示：从荞麦花叶中提取的黄酮具有降糖、降脂、改善胰岛素抵抗、改善微循环、抗氧化和抗炎等作用，并对实验性糖尿病大鼠肾脏具有一定的保护作用。近期对荞麦花叶进行酵母菌发酵处理，发现其黄酮含量有所降低[7]，表明微生物发酵后成分有所改变，且其发酵后的提取物可显著降低db/db小鼠随机血糖[8]，并对db/db小鼠肾组织中血管内皮生长因子(vascular endothetial growth factor,VEGF)和基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)蛋白表达有明显的影响[9]，但其对肾脏的作用尚未明确。本实验是在前期研究的基础上，研究荞麦花叶发酵提取物(extract from fermented buckwheat flower and leaf，EFBFL)对自发肥胖2型糖尿病db/db小鼠的肾脏损伤的保护作用，并进一步探讨其可能的机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物、药品、试剂和主要仪器8周龄SPF级db/db、db/m小鼠，雄性，体质量(35±5)g，购自常州卡文斯实验动物有限公司，动物许可证号：SCXK(苏)2001-0003。荞麦花叶：内蒙古通辽市库伦旗。EFBFL的制备：将活化增殖的酵母菌液加入干燥的荞麦花叶粉末中，给予蛋白胨和葡萄糖营养，置37℃恒温箱中培养48 h，用70%乙醇回流提取2 h，离心取上清液，合并滤液，70℃浓缩干燥，即得EFBFL。小鼠过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)单克隆抗体(货号：sc-7273)和小鼠核因子κB(NK-κB)单克隆抗体(货号：sc-372，美国Santa Cruz Biotechnology. Inc)，Western blotting用兔抗鼠多抗(货号：ab150073，美国Abcam公司)，其他试剂均为国产分析纯。Image-Pro Plus 6.0图像分析软件(美国 Media Cybernetics 公司)，真彩病理图像分析系统(型号HMIAS-2000，高腾科技有限公司)，MV-Ⅱ型双垂直板式电泳槽(大连竞迈生物科技有限公司) ，凝胶成像分析系统(Universal Hood Ⅲ，美国伯乐公司)，全自动生化分析仪(Cobas-8000，德国罗氏制药有限公司)，BX-53型光学显微镜(日本Olympus公司)，日立H-7650透射电子显微镜(日本日立公司)。

1.2 动物分组及给药db/db小鼠适应性饲养1周后，剪尾法取血，用血糖仪测定随机血糖，筛选出随机血糖(RBG)≥16.7 mmol·L-1的实验用鼠30只，再按体质量、血糖分层，随机分为3组，每组10只。模型组：灌胃蒸馏水；低和高剂量EFBFL组：分别灌胃低、高剂量EFBFL(50和100 mg·kg-1EFBFL)；另设db/m小鼠为正常对照组：灌胃蒸馏水。各组小鼠均每天灌胃1次，连续给药8周。

1.3 实验指标检测分别于给药前和给药8周末尾静脉取血用血糖仪测定小鼠血空腹血糖(FBG)；各组小鼠禁食12 h，摘眼球取血，分离血清，用全自动生化分析仪测定血清中血肌酐(SCr) 和尿素氮(BUN)的水平。小鼠处死后立即对其进行解剖，迅速摘取两侧肾脏，去除表面被膜，经生理盐水清洗，滤纸吸干后称质量，一部分置于2%戊二醛溶液保存，一部分置于4%多聚甲醛溶液固定；计算肾脏指数，肾脏指数=双肾平均肾质量(mg)/体质量(g)。

1.4 光镜和电镜下观察小鼠肾组织形态表现4%多聚甲醛溶液固定小鼠肾脏组织，冲水，梯度酒精脱水、二甲苯溶液透明，浸蜡、包埋、切片，HE染色及Masson 染色，光镜下观察肾组织形态表现和肾组织纤维化程度。4%戊二醛溶液固定肾脏组织，采用透射电镜观察肾组织超微结构。

1.5 免疫组织化学法检测小鼠肾组织PPARγ和NF-κB蛋白表达水平石蜡包埋的肾组织连续切片(5 μm)，经脱蜡至水、抗原修复后，加1∶100稀释的一抗4℃过夜，PBS洗3次，加二抗37℃、60 min，PBS洗3次， DAB显色，自来水终止显色，常规梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。以PBS 替代一抗作为阴性对照，在光镜下观察PPARγ和NF-κB蛋白表达及分布(细胞胞膜和胞质内棕黄色颗粒即为阳性信号)。将每张切片在400倍光学显微镜下观察，用 Image-Pro Plus 6.0图像处理系统检测PPARγ和NF-κB的平均积分吸光度(IA)值。

1.6 Western blotting法检测小鼠肾组织PPARγ和NF-κB蛋白表达水平取肾组织在裂解液中制成匀浆，离心后取上清液，采用BCA法测定总蛋白浓度。上样前加入5×buffer，100 μg蛋白样品经电泳分离后电转至PVDF膜，5%的脱脂奶粉封闭1 h后，孵育一抗PPARγ(1∶500)、NF-κB(1∶1 000)4℃缓慢振荡过夜。次日TBST漂洗滤膜5 min×3次，孵育二抗Goat anti-Rabbit IgG/HRP(1∶5 000)稀释，37℃室温振荡孵育1 h，TBST漂洗5 min×3次，加入超敏ECL化学发光试剂，暗室曝光。采用Image J软件进行灰度值分析，以β-actin为内参，结果用目的蛋白与β-actin灰度值的比值表示其相对表达水平。

2 结 果

2.1 给药前后各组小鼠FBG水平给药前后正常对照组小鼠FBG水平无明显变化(P>0.05)；与正常组比较，给药前模型组及EFBFL组小鼠FBG水平明显升高(P<0.05)；给药8周后，与模型组比较， EFBFL组小鼠FBG水平均明显降低(P<0.05或P<0.01)，尤以高剂量EFBFL组效果最为明显。见表1。

表1 给药前后各组小鼠FBG水平

*P<0.05vsnormal control group;△P<0.05,△△P<0.01vsmodel group.

2.2 各组小鼠肾功能指标与正常对照组比较，模型组小鼠血清中的SCr和BUN水平明显升高(P<0.05)，肾脏指数明显降低(P<0.01)；与模型组比较， 高剂量EFBFL组小鼠血清中的SCr和BUN水平明显降低(P<0.05)，低剂量EFBFL组小鼠血清中的SCr和BUN水平降低不明显(P>0.05)；与模型组比较，高剂量EFBFL组小鼠肾脏指数明显升高(P<0.01)，低剂量EFBFL组小鼠肾脏指数升高不明显(P>0.05)。见表2。

表2 各组小鼠肾功能指标

Tab.2 Indexes of kidney function of mice in various groups

表2 各组小鼠肾功能指标

GroupSCr[cB/(μmol·L-1)]BUN[cB/(mmol·L-1)]KidneyindexNormalcontrol20．71±4．526．68±1．811．09±0．09Model25．92±5．01∗8．70±1．27∗0．67±0．05∗∗EFBFL Lowdose24．03±4．237．61±1．680．75±0．08∗∗ Highdose21．25±3．54△7．00±1．29△0．87±0．07∗∗△△

*P<0.05,**P<0.01vsnormal control group;△P<0.05,△△P<0.01vsmodel group.

2.3 各组小鼠肾组织形态表现给药8周后，正常对照组小鼠肾组织中肾小球和肾小管结构正常，未见炎症细胞浸润；与正常对照组比较，模型组小鼠肾组织中肾小球固缩明显，囊腔增大，部分肾小球系膜增生、基底膜增厚，肾间质散在炎细胞浸润及出血点，肾小管细胞水肿明显；与模型组比较，EFBFL组小鼠上述病理改变均有不同程度减轻，高剂量EFBFL组小鼠肾损伤程度明显减轻。见图1(插页四)。

2.4 各组小鼠肾组织纤维化程度给药8周后，正常对照组小鼠肾组织中肾小球清晰，大小正常，可见少量蓝染物质，纤维化程度极低；与正常对照组比较，模型组小鼠肾组织中肾小球系膜基质和肾间质见大量蓝染物质沉积，组织纤维化明显；与模型组比较，EFBFL组小鼠肾组织蓝染物质明显减少，纤维化程度均有不同程度降低。见图2(插页四)。

2.5 各组小鼠肾组织超微结构电镜下观察，正常对照组小鼠肾组织中肾小球结构清晰，肾小球基底膜厚度均匀，足细胞结构完整，足突分布均匀、排列整齐清晰，无融合现象；与正常对照组比较，模型组小鼠肾组织中肾小球基底膜弥漫性增厚，足细胞数量减少，足突增宽、融合甚至消失。与模型组比较，EFBFL组小鼠肾组织上述现象有不同程度改善。见图3。

A： Normal control group； B： Model group；C：Low dose of EFBFL group；D：High dose of EFBFL group.

2.6 免疫组织化学法检测各组小鼠肾组织中PPARγ和NF-κB蛋白表达水平正常对照组小鼠肾组织中PPARγ主要位于肾小球，阳性表达蛋白染色呈棕色；模型组小鼠肾组织中PPARγ呈低表达，阳性染色颗粒数量减少，分布不均匀，颜色呈浅黄色； EFBFL组小鼠肾组织中PPARγ表达明显增强，阳性染色颗粒数量较模型组明显增多，颜色明显加深，其中高剂量EFBFL组增强最为明显(图4，见插页四)。模型组小鼠肾组织中NF-κB表达于肾小管， 高剂量EFBFL组与正常对照组NF-κB表达相当，仅有少量表达(图5，见插页四)。与正常对照组比较，模型组小鼠肾组织中PPARγ蛋白表达水平明显降低(P<0.05)；与模型组比较， EFBFL组小鼠肾组织中PPARγ蛋白表达水平明显升高(P<0.05)，其中高剂量EFBFL组PPARγ蛋白表达水平最高，且与正常对照组比较差异无统计学意义 (P>0.05)。与正常对照组比较，模型组小鼠肾组织中NF-κB蛋白表达水平明显升高(P<0.05)；与模型组比较，EFBFL组小鼠肾组织中NF-κB蛋白表达水平明显降低(P<0.05)，且高剂量EFBFL组与正常对照组比较差异无统计学意义 (P>0.05)。见表3。

表3 各组小鼠肾组织中PPARγ和NF-κB蛋白表达水平

*P<0.05vsnormal control group;△P<0.05vsmodel group.

2.7 Western blotting法检测各组小鼠肾组织中PPARγ和NF-κB蛋白表达水平与正常对照组比较，模型组小鼠肾组织中PPARγ蛋白表达水平明显降低(P<0.05)，NF-κB蛋白表达水平明显升高(P<0.01)；与模型组比较， EFBFL组小鼠肾组织中PPARγ蛋白表达水平明显升高(P<0.05或P<0.01)，NF-κB蛋白表达水平明显降低(P<0.05或P<0.01)，高剂量EFBFL组效果最为明显，且高剂量EFBFL组小鼠肾组织中PPARγ和NF-κB蛋白表达水平与正常对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。与免疫组织化学染色结果一致。见图6。

3 讨 论

糖尿病肾损伤是一个由高血糖启动的、多因素共同参与的渐进性肾脏损伤过程。高血糖作为一个独立的危险因素，是糖尿病微血管病变发生和发展的始动因素[10]。已有研究[11]表明：db/db 小鼠处于高血糖状态，易发生肾脏病变，表现为尿蛋白增高、系膜细胞增生、基质增加和基底膜增厚等肾脏结构破坏，随着高血糖进展，肾脏病变进一步恶化。db/db 小鼠与2型糖尿病患者有类似的肾脏病变，本研究采用db/db 小鼠作为研究对象可以较好模拟2型糖尿病肾损伤的特征[12]。本研究结果显示：db/db小鼠给予EFBFL治疗后，与模型组比较，其血糖、肾脏组织学病变和肾功能均有不同程度改善，表明EFBFL可在一定程度上减轻小鼠肾损伤，且有一定的降血糖功能，提示EFBFL对高血糖引起的肾脏疾病具有一定的治疗作用。

n=3,±s;*P<0.05,**P<0.01 vs normal control group; △P<0.05,△△P<0.01 vs model group.

随着对糖尿病肾损伤的深入研究，其被认为是与先天免疫有关的慢性炎症疾病。糖尿病患者的长期高血糖环境，可促使机体促炎因子及炎症介质大量产生，攻击肾脏组织并加重糖尿病肾损伤发生[13]。糖尿病肾损伤患者微炎症状态与肾功能损伤程度直接相关。过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome pro-liferator-activated receptors,PPARs) 是一类配体激活的核转录因子，其亚型之一PPARγ在降低血糖、调节脂类代谢和抗炎过程中发挥重要作用[14-15]。NF-κB是调控机体免疫和炎症反应的重要转录因子，阻断NF-κB通路具有多重的抗炎作用。进一步的研究[16]表明：PPARγ-NF-κB途径是调控炎症反应的一个重要的靶点，PPARγ通过降低NF-κB的活性或抑制其活化，可以下调炎症基因的表达，从而调节炎症通路，最终缓解炎症反应。本研究结果显示：与模型组比较，EFBFL可明显升高db/db小鼠肾脏组织中PPARγ的蛋白表达水平，下调NF-кB蛋白表达水平，表明EFBFL通过激活PPARγ减少NF-кB的转录活性，减少淋巴细胞产生促炎分子，促进免疫系统产生抗炎症分子，改善炎症反应，减轻肾功能的损伤，延缓肾损伤的进展。与此同时， EFBFL在一定程度上可激活PPARγ信号通路，从而降低血糖，增加肾脏组织胰岛素敏感性，改善肾脏糖代谢异常，抑制肾脏损伤。

综上所述，EFBFL可降低db/db小鼠血糖，改善肾组织的损害程度，减缓糖尿病的症状。其机制可能是通过调控炎症反应PPARγ-NF-κB这一重要靶点，改善炎症反应及肾脏功能；与此同时，EFBFL能增加小鼠肾脏组织内PPARγ蛋白表达，降低血糖，增加肾脏组织对胰岛素的敏感性，对肾脏起到一定的保护作用。本研究为荞麦花叶的深入研究提供了新的思路，为荞麦花叶的开发再利用提供了新的研究方向。

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