染色体9p21遗传变异与中国汉族人群冠心病的关联性

郑东春，张天融，刘洪泊，陈怀基，王 琪，许 峰，张月竹，周丽婷，叶 琳

(1.吉林大学公共卫生学院劳动卫生与环境卫生学教研室，吉林 长春130021；2. 中国人民解放军第202医院感染控制科，辽宁 沈阳 110003 )

冠心病(coronary heart disease，CHD)是世界范围内严重威胁人类生命健康的一种最为常见和多发的心血管疾病，是多数发达国家和许多发展中国家成人死亡的主要原因。据统计目前我国冠心病患者有1 100万[1]。我国急性心肌梗死死亡率总体呈上升趋势，根据《2016年中国卫生和计划生育统计年鉴》，2015年中国城市居民冠心病死亡率为110.67/10万，农村居民冠心病死亡率为110.91/10万[2]。环境因素和遗传因素被认为在冠心病发生中起着重要作用，但是目前冠心病的遗传学基础尚未完全阐明。

全基因组关联研究[3-4]显示：在染色体9p21区域存在新的与白种人冠心病相关联的易感位点。之后一些国家的学者及国际合作研究小组对9p21区域相关位点遗传变异与冠心病的关系在不同地区不同人群中开展了验证试验[5-11]，得到的研究结果并不一致。

染色体9p21区域具有高度连锁不平衡特性，已报道的与冠心病关联的9p21区域长度约为100 000 bp，含有大量单核苷酸多态性(SNPs)位点。本研究以中国东北汉族冠心病患者和健康对照人群为研究对象，对染色体9p21区域rs2383206和rs2383207位点的多态性进行检测，探讨rs2383206和rs2383207位点遗传变异与中国人群冠心病的关系。目前尚无关于该位点遗传变异与中国东北汉族人群冠心病的关联性研究。本研究可为冠心病的病因学研究奠定基础，并为冠心病的进一步预防和干预提供参考。

1 资料与方法

1.1 研究对象以中国东北汉族冠心病患者和排除冠心病的健康人为研究对象，分成病例组和对照组。病例组为2009—2012年在吉林大学第一医院心内科住院治疗的冠心病患者，共580例。入选标准：①临床表现及心电图变化均符合1979年WHO制定的冠心病诊断标准；②经冠状动脉造影显示至少有1支冠状动脉管腔狭窄≥50%；③个体间无血缘关系。排除标准：①并发其他心脏疾病如扩张型心肌病和风湿性心脏病等；②严重的肝肾疾病；③既往接受静脉溶栓、冠状动脉支架植入术或冠状动脉旁路移植术的患者。对照组为同期在吉林大学第一医院体检中心体检健康的无冠心病病史的人群，入组对象均经病史询问、体检、心电图检查和其他血液生化检查无异常发现，且以前无冠心病病史，共539人。

经知情同意后，通过现场询问和体检，结合复查病历和体检报告，收集所有研究对象的流行病学资料，并采集空腹抗凝静脉血5 mL。本研究的所有样本收集和检测均经吉林大学公共卫生学院医学伦理委员会批准。

1.2 基因组DNA提取使用天根DNA提取试剂盒从全血中提取基因组DNA。采用美国BECKMAN公司生产的Du640型紫外分光光度计测定提取DNA 的纯度和浓度，以A(260)/A(230)值位于1.8～2.0间，且A(260)/A(230)>2.0为合格样本。

1.3 位点选择和引物设计选择目前报道的9p21区域与冠心病强相关的位点rs2383206和rs2383207为待测位点，采用Assay Designer 3.1软件进行引物扩增、延伸和引物设计，引物序列见表1。

1.4 基因分型将DNA 样本稀释至5 mg·L-1，使用Ex Taq 聚合酶，在384 孔板常规扩增待测片段(PCR 反应条件：94℃、5 min；94℃、30 s，55℃、30 s，72℃、30 s，40个循环；72℃、3 min)，在PCR 产物中加入2 μL 碱性磷酸酶以除去未用尽的dNTPs(反应条件：37℃、60 min，85℃、10 min)。根据SEQUENOM 程序进行单碱基延伸反应， 反应条件：94℃、15 min；94℃、5 s,(52℃、5 s，80℃、5 s，5个循环),40个循环；72°C、3 min。在终止反应物中加入6 mg 阳离子交换树脂脱盐，混合后补充16 μL蒸馏水。用纳升点样仪将产物分点在质谱微阵列芯片上。在Typer 4.0操作程序中编辑相对应的引物和样本，并按顺序读取相对应的SNPs 分型数据。

表1 rs2383206和rs2383207位点扩增引物及延伸引物序列

1.5 统计学分析采用SPSS 13.0统计软件进行统计学分析。应用拟合优度χ2检验分析基因型分布是否符合Hardy-Weinberg平衡定律。采用χ2检验分析病例组和对照组受试者性别、吸烟、饮酒、高血压病史、糖尿病史和基因频数分布差异；病例组和对照组受试者年龄、体质量指数(BMI)、腰臀比(WHR)、收缩压(SBP)、舒张压(DBP)、总胆固醇(TC)和甘油三酯(TG)正态性检验结果均呈正态分布，故组间比较采用t检验。检验水准为α=0.05。

2 结 果

2.1 2组受试者基本情况病例组和对照组受试者性别和年龄比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。病例组冠心病患者吸烟、高血压病史和糖尿病史所占比例明显高于对照组人群(P<0.01)，WHR、SBP、DBP和TC水平也明显高于对照组(P<0.05或P<0.01)。见表2。

表2 病例组和对照组受试者基本情况

2.2 Hardy-Weinberg平衡检验对照组和病例组受试者染色体9p21上rs2383206和rs2383207位点的基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡定律(P>0.05)，表明本研究人群为随机婚配的自然群体。见表3。

表3 基因型频数分布的Hardy-Weinberg平衡检验

2.3 2组受试者SNPs 位点基因型频数分布病例组和对照组人群中rs2383206位点的基因型分布比较差异无统计学意义(P>0.05);病例组和对照组人群中rs2383207位点基因型频数分布比较差异有统计学意义(P<0.05)，其中AA基因型在病例组频数(8.3%)分布明显低于对照组(13.6%)。见表4。

3 讨 论

冠心病是由环境危险因素和遗传因素共同作用的一种多基因遗传疾病。以往的研究[12-15]表明：高血压、吸烟、血脂异常、肥胖与超重、血糖异常、不良饮食习惯、精神压力和自然环境的改变等是冠心病的危险因素。本研究结果显示：2组受试者吸烟、WHR、高血压病史、糖尿病史、SBP、DBP和TC水平比较差异均有统计学意义，病例组人群中吸烟、有高血压病史和糖尿病病史患者所占的百分比明显高于对照组，且WHR、SBP、DBP和TC水平也明显高于对照组。本研究结果表明：吸烟、WHR、高血压病史、糖尿病史、SBP、DBP和TC水平均是冠心病的危险因素。

表4 SNPs 位点基因型频数分布及其与冠心病的关系

9p21区域的遗传变异与冠心病发生有关，9p21区域已成为研究冠心病遗传学病因的热点区域。我国的很多学者也在中国汉族人群中对此进行了验证和探讨，得到的结论并不完全一致。田朝伟[8]和周莉[10]的研究结果表明：rs2383206位点可能不是中国汉族人群冠心病的易感位点；而张琦等[9]、Lv等[7]和Ding等[6]的研究结果表明：rs2383206位点是中国汉族人群冠心病的易感位点。本研究结果显示：rs2383206位点的基因型在病例组和对照组人群中分布比较差异无统计学意义，但是AA基因型在病例组中的频数分布低于对照组。本研究结果还显示：rs2383207位点的基因型在病例组和对照组人群中频数分布比较差异有统计学意义，其中病例组患者AA基因型频数(8.3%)分布明显低于对照组(13.6%)，表明rs2383207位点AA基因型可能是冠心病的保护基因型。

染色体9p21 区域中包括细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂的编码序列CDKN2A 和CDKN2B，与动脉粥样硬化关系密切[16]。近年来有些研究[17-20]提示：9p21 区域CDKN2A 和CDKN2B 基因的编码序列与2 型糖尿病和中风等疾病也存在着一定的关联，表明9p21 区域在多种复杂疾病过程中可能发挥很大的作用。进一步的研究应集中在染色体9p21区域影响冠心病等疾病发病的机制上。

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