油菜茎基溃疡病菌LAMP-HNB检测方法的建立

龙 阳，马新华，袁俊杰，卢乃会，杨卓瑜，魏 霜，王卫芳

（1.湛江出入境检验检疫局，广东 湛江 524042；2.广东出入境检验检疫局，广东 广州 510623）

油菜茎基溃疡病菌是油菜上最严重的真菌病害之一，是我国重要的检疫性有害生物［1］。近年来，湛江口岸多次从进境油菜籽样品中截获该病菌。油菜茎基溃疡病菌正严重威胁着我国油菜产业的生产安全，高效快速检测技术成为预防油菜茎基溃疡病传入我国的关键措施之一。目前油菜茎基溃疡病菌常用检测方法主要有分离培养法、聚合酶链式反应（PCR）检测法以及发病症状观察法［2-4］。其中，分离培养法培养时间长，工作量大，如果完全通过分离培养来完成对病害的检疫鉴定，针对性差，费时费力，与快速通关的需求不符；PCR检测法具有快速、准确、重复性好的优点，但是其对检测设备和检测人员要求较高，难以适用于多种检测环境；发病症状观察法由于某些病原引起的症状相似，较难准确判定。本研究采用的环介导等温扩增技术区别于传统的PCR法［5］，其不需要昂贵的PCR仪器，且特异性强、灵敏高、操作简单、扩增反应时间较短，比较容易在基层实验室推广使用等优点，目前已广泛应用于各类植物病原菌的检测工作中。张裕君等［6］应用该技术成功检测了苜蓿疫霉根腐病菌，Tomlinson等［7］等建立了灰霉病菌的LAMP检测方法，Niessen等［8］运用LAMP技术检测出了禾谷镰刀菌，田擎等［9］检测了黑白轮枝菌，戎振洋等［10］以TAT基因为靶标设计了一套用于检测水稻中Fusarium andiyazi的LAMP检测方法。虽然LAMP技术存在诸多优点，但也存在易污染、假阳性等缺陷［11］。

本研究通过在建立的油菜茎基溃疡病菌LAMP检测反应体系中添加羟基萘酚蓝（hydroxy naphthol blue，HNB）反应指示剂［12］，反应完成后可以以通过肉眼直接对结果进行判定，无需再开盖检测，可以有效避免气溶胶污染，预防LAMP检测过程中常见的假阳性问题，一定程度上克服了LAMP技术易污染的缺点，对预防油菜茎基溃疡病传入我国具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 试验材料

油菜茎基溃疡病菌L. maculans阳性DNA来源于《CNCA-15-A03油菜茎基溃疡病菌检测》能力验证阳性样品。 燕麦细镰刀菌Fusarium avenaceum、链格孢属Alternariasp.、茎点霉属Phomasp.、核盘菌Sclerotinia sclerotiorum；油菜黑胫病菌L.biglobosa分离于进口加拿大油菜籽。取10批油菜籽样品，按照《GB/T31793-2015油菜茎基溃疡病菌检疫鉴定方法》中4.1的要求对其进行前处理。

植物基因组DNA提取试剂盒DP305-03，购自TIANGEN公司； DL2000 Premix DNA Marker购自Takara公司；Bst 2.0 WarmStart DNA聚合酶购自New England Biolabs公司;羟基萘酚蓝（HNB）购自Sigma公司；引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2 试验方法

1.2.1 基因组DNA的提取 按照植物基因组DNA提取试剂盒DP305-03的要求对1.1中样品进行基因组DNA提取。

1.2.2 引物设计 参考LAMP引物设计方法和要求［1］，根据油菜茎基溃疡病菌ITS保守序列设计LAMP引物1套（表1）。常规PCR引物参照《GB/T 31793-2015油菜茎基溃疡病菌检疫鉴定方法》4.5.2常规PCR方法一中的引物，产物大小为 279 bp［13］。

表1 油菜茎基溃疡病菌LAMP检测引物序列

1.2.3 LAMP-HNB反应体系的建立及优化 对LAMP反应体系中的Mg2+浓度（1～6 mmol/L）、dNTPs浓度（0.2～2 mmol/L）、F3/B3引物浓度（0.1～0.5 μmol/L）、FIP/BIP引物浓度（0.4～2.0 μmol/L）、HNB 浓度（50～250 μmol/L）、Bst DNA聚合酶浓度（0.08～0.64 U/μL），反应温度（60～70℃）及反应时间（30～90 min）进行优化。

1.2.4 LAMP-HNB特异性评价 按照1.2.3中LAMP反应体系，以1.2.1中提取的5个样品基因组DNA为模板，以油菜茎基溃疡病菌基因组DNA为模板做阳性对照，以水为模板做阴性对照，对所建立的LAMP-HNB反应体系的特异性进行评价。

1.2.5 LAMP-HNB灵敏度评价 以1.2.1的方法提取油菜茎基溃疡病菌基因组DNA，用核酸蛋白分析仪标定浓度为100 ng/μL，再按10倍梯度稀释为 10 、1、0.1、0.01、0.001 ng/μL的模板浓度，共6个模板浓度，分别取2 μL作为模板按照1.2.3的方法进行灵敏度实验。

1.2.6 LAMP-HNB体系对实际样品的检测 利用LAMP-HNB体系对10批油菜籽样品进行检测，将得到的结果与常规PCR检测结果进行比较分析。

2 结果与分析

2.1 LAMP-HNB检测方法建立

通过调整优化LAMP反应体系，确定最终反应体系为10×等温扩增反应缓冲液2.5 μL，Mg2+4.0 mmol/L，dNTP Mix 1.0 mmol/L，F3、B3引物终浓度0.2 μmol/L，FIB、BIP引物终浓度1.6 μmol/L， HNB150 μmol/L，Bst2.0 WarmStart DNA聚合酶0.16 U/μL，DNA模板2.0μL，ddH2O调节最终体积至25μL。反应条件为62℃ 80 min。结果见图1（彩插二），阳性样品显示为天蓝色，阴性对照未反应为浅蓝色；LAMP反应产物经琼脂糖凝胶电泳验证，阳性样品有典型的LAMP反应条带，阴性对照无反应条带，与显色反应一致。

2.2 LAMP-HNB特异性评价

如图2（彩插二）所示，仅油菜茎基溃疡病菌阳性DNA发生扩增反应变为天蓝色，其他5种油菜籽中常见的菌株均未发生扩增反应，呈浅蓝色。表明所建立的LAMP-HNB检测方法特异性强。

2.3 LAMP-HNB灵敏度评价

如图3（彩插二）所示，当DNA模板量在0.01 ng/μL以上时，LAMP-HNB均能发生扩增反应而显色，而常规PCR检测在0.1 ng/μL时结果已经较为微弱，低于0.1 ng/μL时已经无法获得阳性结果，LAMP-HNB方法的灵敏度是常规PCR的10倍。

2.4 LAMP-HNB对实际样品检测结果

如图4（彩插二）所示，利用LAMP-HNB及常规PCR对10批油菜籽样品进行检测，检出5批阳性样品，两者检测结果一致。

3 讨论

LAMP方法是一种灵敏度极高的检测方法，其灵敏度一般可达到普通PCR的10倍以上，因此如果采用常规的琼脂糖凝胶电泳对其产物进行判定，极易产生气溶胶污染，导致检测结果假阳性。为避免污染的产生，闭管检测并直接进行结果判定的方法被广泛研究，目前闭管判定常用的方法有目视浊度法、浊度仪检测法、染料显色法等三大类，由于LAMP反应中会产生大量的焦磷酸根离子，其能与反应体系中的镁离子结合生成焦磷酸镁白色沉淀，这为肉眼判定结果提供可能，但是当浊度较低时，肉眼难以准确判定；浊度仪检测法主要依靠专用设备实时对反应体系中的浑浊度进行检测，但是其需要专用设备，不利于现场快速检测；染料显色法是目前LAMP闭管检测研究应用的重点方向，其中钙黄绿素显色法会降低反应灵敏度，SYBR Green染料显色需经特殊处理或反应后开盖加入，各有弊端［11，13-14］。本研究采用的羟基萘酚蓝显色法不需额外添加任何成分，对反应体系影响较小，现已被广泛应用，但需注意的是，阴性反应显色结果与反应体系中是否存在甜菜碱相关，当存在时，呈紫罗兰色，当不存在时，则呈浅蓝色［6，10，12］。

油菜茎基溃疡病是油菜上最严重的真菌病害之一，其致病力强，造成损失大，据估计，全世界因此病而造成油菜经济损失超过3亿欧元［15］。该病原菌广泛分布于亚洲、非洲、美洲、欧洲及大洋洲等地，但在我国还未见报道。该病菌能通过植株、种子等进行远距离传播，我国是油菜种植大国，且各方面条件都适宜该病菌繁衍，因此一旦该病菌传入我国并定殖，可能会对我国相关产业造成毁灭性破坏。本研究建立的油菜茎基溃疡病菌LAMP-HNB检测方法，具有特异性强、适用范围广的优点，适用该病菌的快速筛检，运用该方法对实际样品进行检测，结果与GB/T 31793-2015中PCR方法检测结果一致，且耗时更短，对油菜茎基溃疡病菌的快速筛查具有较强的实用价值。

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