低温连续相变萃取油茶籽粕中抑菌物质及其抑菌活性研究

丘苑新，赵 丽，曹 庸，柳建良

（1.仲恺农业工程学院轻工食品学院，广东 广州 510225；2.华南农业大学食品学院，广东 广州 510642）

国内外对植物中功能性活性物质的提取方法有传统的水提和醇提法，也有亚临界流体提取和超临界CO2提取法等先进的提取方法，前者提取的成分比较复杂、得率低、对所提取成分的破坏性大，后者用低温提取，所得成分活性强、提取率高，但条件要求高、产能低、生产成本高、难以实现工业化大生产。低温连续相变萃取是以亚临界状态的流体或亚临界流体的混合溶液为溶媒，与溶质在系统内相继经过浸提、蒸发分离、浓缩、冷凝回收等过程，从天然产物中提取目标组分的一种新技术。当液化石油气、丙烷、丁烷、异丁烷、甲醚、四氟乙烷和六氟化硫等以亚临界流体状态存在时，分子的扩散性能增强，传质速度加快，对天然产物中弱极性以及非极性物质的渗透性和溶解能力显著提高。亚临界环境下萃取，不破坏热敏性成分、目的物完全，被视为绿色环保、前景广阔的一项变革性技术［1］。本研究采用低温连续相变的提取方法对油茶籽粕中的抑菌物质进行提取［2］，以不同浓度的乙醇作为夹带剂，以一定流速流经萃取釜萃取茶油进入解析釜中，在解析釜中通过加热、减压使萃取剂相变为气态，再通过即时冷却降温，萃取剂相变为液态回流至溶剂桶中，再通过压力泵压缩至萃取釜中萃取物质，如此不断循环获得提取物。此法提取目标性强、得率高，并可连续生产，具有很大的应用前景［3］。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试油茶籽粕由广东瑞丰农科有限公司提供，将榨油后的油茶粕烘干粉碎，过孔径0.075 mm筛［4］，备用；供试菌种包括大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、黑曲霉，由华南农业大学食品学院微生物实验室保藏，均为广东省微生物所提供。

试剂包括95%乙醇、芦丁（标准品，纯度98%）、亚硝酸钠、硝酸钠、香草醛、微生物培养基，均购于广州君烨试剂有限公司。仪器设备包括连续相变萃取设备（华南农业大学食品学院自行设计制造）、R201BL型旋转蒸发仪（上海申生科技有限公司）、TDL-5型台式离心机（上海安亭科技仪器厂）、FW100型高速万能粉碎机（天津市华鑫仪器厂）、FD-1型冷冻干燥机（北京博医康技术公司）、U-3010紫外可见分光光度计（日本日立公司）、XW-80A漩涡混合器（上海精科实业有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 单因素试验 （1）称取油茶籽粕1.5 kg，固定萃取压力0.4 MPa、萃取温度80℃、萃取时间2 h，设萃取剂乙醇浓度为50%、60%、70%、80%、90%。提取液减压浓缩后冻干，用于对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌及黑曲霉的抑菌实验［5］。（2）称取油茶籽粕 1.5 kg，固定乙醇浓度为80%、萃取时间2 h、萃取温度80℃，设萃取压力为 0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 MPa。提取液减压浓缩后冻干，用于对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌及黑曲霉的抑菌实验。（3）称取油茶籽粕1.5 kg，固定乙醇浓度为80%、萃取压力0.4 MPa、萃取时间2 h，设萃取温度为50、60、70、80、90℃。提取液减压浓缩后冻干，用于对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌及黑曲霉的抑菌实验。（4）称取油茶籽粕1.5 kg，固定乙醇浓度为80%、萃取压力0.4 MPa、萃取温度80℃，设萃取时间为1、2、3、4、5 h。提取液减压浓缩后冻干，用于对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌及黑曲霉的抑菌实验。

1.2.2 正交实验 根据单因素试验所得的最优实验条件，设计L9（34）正交实验，具体见表1，研究不同乙醇浓度、萃取时间、萃取温度、萃取压力等因素下所得提取物的含量，并根据极差直观分析，得出最佳萃取工艺条件。

表1 低温连续相变提取抑菌物质L9（34）正交实验因素水平

1.2.3 抑菌活性检测方法 细菌抑菌实验：选用大肠杆菌和金黄色葡萄球菌作为供试菌，测定抑菌圈直径大小；霉菌抑菌实验：选取黑曲霉作为供试菌，测定抑菌圈直径大小［6-8］。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 乙醇浓度对油茶籽粕提取物抑菌活性的影响 由图1可知，随着乙醇浓度的逐渐升高，油茶籽粕粗提物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌及黑曲霉的抑菌活性均有增大的趋势，其中以80%乙醇提取物抑菌圈最大，说明其抑菌活性最强。因此，在正交实验设计中，以80%乙醇设为中心点，由此也可见，提取介质的极性对提取物的抑菌活性是有影响的，这与很多研究结果［9］相一致，80%乙醇能提取到抑菌活性较强的抑菌物质，可能是大部分抑菌活性物质的极性与80%浓度乙醇的极性相当。

图1 不同浓度乙醇对油茶籽粕提取物抑菌活性的影响

2.1.2 萃取压力对油茶籽粕提取物抑菌活性的影响 图2显示，随着系统萃取压力的逐渐升高，抑菌活性有所变化，但规律不明显，当萃取压力达到0.5 MPa后，提取物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌及黑曲霉的抑菌效果保持在较高水平。因此，选取压力为0.5 MPa用于正交实验设计，过低的压力不利于提取介质的流动，过高的压力不利于抑菌活性物的溶出［10］。

图2 不同萃取压力对油茶籽粕提取物抑菌活性的影响

2.1.3 萃取温度对油茶籽粕提取物抑菌活性的影响 由图3可知，随着萃取温度的逐渐升高，提取物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌及黑曲霉的抑菌活性都有增大的趋势，当萃取温度超过80℃后，抑菌活性呈现逐步下降的趋势。这可能是因为在一定温度范围内，温度的升高有利于物料中抑菌活性物的渗出，但过高的温度会损伤抑菌物的活性［11］。因此，选取80℃为低温连续相变萃取油茶籽粕的提取温度。

图3 不同萃取温度对油茶籽粕提取物抑菌活性的影响

图4 不同萃取时间对油茶籽粕提取物抑菌活性的影响

2.1.4 萃取时间对油茶籽粕提取物抑菌活性的影响 从图4可以看出，随着萃取时间的逐渐延长，提取物对3种菌的抑菌圈变化不明显，在提取2 h时提取物抑菌圈较大，当萃取时间超过2 h以后抑菌圈的直径没有明显增大，即提取时间对抑菌活性的影响不显著，延长提取时间与提取物得率关系不大。因此，选取2 h为正交实验的提取时间。

2.2 正交实验结果

为考察各因素间的交叉影响，在以上单因素试验的基础上，以提取物的抑菌活性为考察指标，以乙醇浓度（A）、萃取时间（B）、萃取压力（C）、萃取温度（D）为因素，设计L9（34）正交实验研究连续相变萃取对活性物质提取的分离效果，研究以上4个因素与提取物抑菌能力之间的关系，并根据极差分析、直观分析优化最佳提取工艺条件。从正交实验结果（表2）可以看出，提取物对大肠杆菌具有最强抑菌活性的提取工艺条件是A2B1C2D1，对金黄色葡萄球菌和黑黄霉具有最强抑菌活性的提取工艺条件均为A2B3C1D2。可见，乙醇浓度对油茶籽粕提取抑菌活性物的影响比较大、也比较确定的都是80%浓度的乙醇，其他3个因素对抑菌效果的影响因指标不同而有所变化，对金黄色葡萄球菌与黑曲霉的抑制作用，具有最强抑菌效果的提取工艺参数相同。

从因素指标分析可知，乙醇浓度和萃取温度对3种菌的抑菌活性影响最大，抑菌活性达最大时乙醇浓度均为80%、萃取温度均为80℃，提取物同时对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌及黑曲霉3种菌具有较高抑菌活性的萃取压力水平是0.4 MPa。对于因素萃取时间（B）的水平选择，参考单因素试验，萃取时间对抑菌物抑菌活性的影响不大，推测是由于受高温影响，太长的萃取时间对抑菌活性物有一定的破坏作用，因此萃取时间选取1 h进行验证。

因此，在本研究的试验条件下，各因素最优水平分别为萃取介质是80%乙醇、萃取时间为1 h、萃取压力为0.4 MPa、萃取温度为80℃。对以上因素水平进行实验验证，其提取物冻干后对大肠杆菌的抑菌圈直径为13.6 mm，对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径为15.1 mm，对黒曲霉的抑菌圈直径为13.8 mm，达到最好的抑菌效果。

3 结论与讨论

低温连续相变萃取技术可选择的溶剂极性范围广、提取针对性强、得率高，且可同时配置多个萃取釜以实现连续性生产；分离提取和浓缩一并完成，可节省能源；提取装置构造简单，对材料要求不高，是一种可实现工业化大生产的极为有效的提取技术。连续相变萃取技术适用于大部分天然产物的萃取，若加以改进，还可形成两条萃取回路，整个萃取过程中，萃取剂的相变过程是即时的、连续的，且萃取剂循环使用，溶剂使用量少，可减少对环境的污染。同时，采用低温连续相变萃取可以针对提取物的极性来调整提取介质的极性，且条件温和、易于操控、危险性小［12］。本研究所选用的乙醇及水混合液在真空状态下，60℃左右的温度可以实现相变，是一种极好的极性提取介质。采用低温连续相变萃取方法以乙醇作为提取介质，可以提取出油茶籽粕中具有抑菌活性的物质。本研究得到最优的油茶籽粕活性物连续相变提取的工艺条件为：乙醇浓度80%、萃取时间1 h、萃取压力0.4 MPa、萃取温度80℃。在此条件下其提取物冻干后对大肠杆菌的抑菌圈直径为13.6 mm、对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径为15.1 mm、对黑曲霉的抑菌圈直径为13.8 mm，达到最好的抑菌效果。

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