糖类检材上脱落细胞采集方法的比较

陆永佳，张 辉 ，高林林

（1.桐庐县公安局，浙江 杭州 311500；2.舟山市公安局刑事科学技术研究所，浙江 舟山 316021；3.杭州市公安局刑事科学技术研究所，浙江 杭州 310004）

刑事案件中常遇到以糖类为载体的生物检材，虽然有成功获取DNA的案例报道[1]，但由于糖的特殊性，从该类载体上转移、提取DNA一直未见系统研究。本研究以奶糖、硬糖、软糖3种类型的糖为代表，通过4种DNA采集方法比较其STR检出率，以此来寻求最适合糖类生物检材上附着脱落细胞的DNA采集方法。

1 材料与方法

1.1 样本

采购大白兔奶糖（奶糖）、上好佳柑橘味硬糖（硬糖）、桂花牛皮糖（软糖）各20枚。随机选取20名志愿者，每名志愿者对每种糖进行分时段含嚼，含嚼时间为30s，在含嚼每种糖之前用矿泉水充分漱口。对含嚼过的每枚糖平均分成4份，共制备检材240份。室温放置24h后进行脱落细胞采集。

1.2 主要仪器及试剂

4N6FLOQSwabsTM植绒拭子（意大利Copan Flock Technologies公司），脱落细胞粘取器（15 mm×15 mm，博坤生物科技有限公司），生物物证提取专用棉签（北京毕思特联合科技有限公司），9700型PCR仪、3130xl基因分析仪（美国AB公司）。Hi-Di甲酰胺溶液、AmpFℓSTR®Identifiler®Plus试剂盒（美国 AB 公司），15%硅珠悬液、Lysis Buffer裂解液、Elution Buffer洗脱液（美国Promega公司）。

1.3 方法

1.3.1 脱落细胞的采集

采用4种方法收集糖类载体上的脱落细胞。

方法一：生物物证提取专用棉签两步擦拭法。先将一根生物物证提取专用棉签蘸取少量水，使用该微湿的棉签擦拭糖的表面，再用另一根干的生物物证提取专用棉签重复擦拭糖的表面，剪取两根棉签，置于1.5mL的微量离心管中。

方法二：脱落细胞粘取器粘取法。使用大号脱落细胞粘取器（15 mm×15 mm）用力粘取糖表面脱落细胞，将该粘取面置于1.5mL的微量离心管中。

方法三：植绒拭子擦拭法。使用4N6FLOQSwabsTM植绒拭子擦拭糖表面，剪取植绒拭子，置于1.5mL的微量离心管中。

方法四：直接提取法。直接将糖粒放入1.5mL的微量离心管内。

1.3.2 DNA的提取

所有检材均采用改良硅珠法[2]提取，加入Lysis Buffer裂解液400μL，95℃裂解30min，离心后取上清液移入新的离心管内，加入15%的硅珠悬液30μL，室温静置15min，70%冷乙醇溶液洗涤2次后用Elution Buffer洗脱液，洗脱终体系为30μL。

1.3.3 模板DNA扩增

提取的模板DNA使用AmpFℓSTR®Identifiler®Plus试剂盒扩增，扩增体系为10μL，其中缓冲液4μL，引物 2 μL，模板 DNA 2 μL，其余用超纯水补足。 在9700型PCR仪上扩增，扩增参数按试剂手册进行。

1.3.4 数据分析

取PCR产物 1 μL加入 9 μL混有Liz500的Hi-Di甲酰胺溶液中，在3130xl基因分析仪上进行毛细管电泳。收集的数据采用GeneMapper®v3.2分析。

2 结 果

2.1 不同采集方法的STR检验结果

4种不同的采集方法所获得的STR数据各有差异（表1～4），根据基因座的检出情况，将结果分成完全检出、部分检出（检出基因座为10～14个）及未检出3种情况。用直接提取法收集脱落细胞时，由于软糖类检材在裂解液加热过程中变浑浊，无法离心获得上清液，故该组检材无DNA数据。直接提取法的完全检出率仅为13.3%，植绒拭子擦拭法的完全检出率则高达98.3%，生物物证提取专用棉签两步擦拭法和脱落细胞粘取器粘取法的完全检出率分别为86.7%和66.7%。

表1 生物物证提取专用棉签STR检出率比较

表2 脱落细胞粘取器STR检出率比较

表3 植绒拭子STR检出率比较

表4 直接提取STR检出率比较

2.2 3种不同类型糖的STR检验结果

以桂花牛皮糖为代表的软糖除了直接提取法外，其余3种采集方法的STR检出率在85%～95%。以大白兔奶糖为代表的奶糖用直接提取法只有少量样本获得了STR分型，植绒拭子擦拭法及生物物证提取专用棉签两步擦拭法的检出率均为100%，脱落细胞粘取器粘取法的检出率稍有下降。而以上好佳柑橘味硬糖为代表的硬糖，直接提取法的检验结果均为阴性，脱落细胞粘取器粘取法的检出率也仅仅为30%，生物物证提取专用棉签两步擦拭法的成功率可提高到65%，而植绒拭子擦拭法的成功率则为100%。

3 讨 论

植绒拭子擦拭法的检出率最高，在3种类型的60份糖类检材中仅有1份检材获得部分STR分型数据，其余均获成功。究其原因可能与4N6FLOQSwabsTM植绒拭子的结构有非常密切的关系。4N6FLOQSwabsTM植绒拭子上尼龙纤维结构垂直于基底，在擦拭中不易与糖表面相互黏附，而且其利用专利的棉绒填充技术最大程度地提高了DNA采集和洗脱效率，DNA的释放效果更好。

生物物证提取专用棉签两步擦拭法和脱落细胞粘取器粘取法检出效果相对较好。糖的配料中一般含有白砂糖、食品添加剂等物质，不同类型的糖经过口腔唾液浸润后，表面变得非常黏，糖表面的黏附力影响操作导致部分棉签纤维黏附于糖表面，因此细胞收集、转移都不够充分。由于糖粒一般较小，脱落细胞粘取器在粘取过程中与检材表面无法完全贴合，具有黏性的糖表面与同样具有黏性的脱落细胞粘取器表面存在相互竞争的可能。因此，这两种采集方法获得的STR检出率比4N6FLOQSwabsTM植绒拭子都有所下降。

直接提取法效果最差。糖本身容易溶解，使得糖表面附着的口腔上皮脱落细胞充分被溶解到裂解液中，但由于糖的配料里含有白砂糖、食品添加剂、着色剂等物质，其含有的蛋白质类、脂类、糖类对PCR反应会产生较强的抑制作用。因此，直接提取法的检出率远远低于其他3种方法。

奶糖和软糖中由于含有果胶或卡拉胶等成分，糖的含量有所降低，糖表面的黏附力不如硬糖高，因此在硬糖中植绒拭子擦拭法相较于其他3种方法检出率明显提高。而在奶糖与软糖中可以选择价格相对低廉的生物物证提取专用棉签两步擦拭法。由于糖表面具有黏附力，在用生物物证提取专用棉签擦拭奶糖与软糖表面的脱落细胞时，可将奶糖或软糖置于冰箱冷冻片刻，待表面较硬时再进行脱落细胞的转移操作。

综上所述，4种不同的采集方法中，直接提取法要直接摒弃，脱落细胞粘取器粘取法也不太适合应用于糖类生物检材。生物物证提取专用棉签两步擦拭法在软糖与奶糖类的生物检材中可以选择使用，而植绒拭子擦拭法对于糖类检材均适用，并可取得较好的检验结果，但由于植绒拭子本身价格稍显昂贵，可针对性地在陈旧、脏、污染比较严重的疑难糖类载体上进行脱落细胞的采集。

[1]徐伟.奶糖表面提取DNA成功分型1例[J].刑事技术，2011（5）：47.

[2]高林林，李佑英，叶家喜，等.触摸检材DNA的STR检验[J].刑事技术，2009（3）：56-57.