乙醇—硫酸铵双水相提取鱼腥草总黄酮

郝红英+周芳+王改利+高阳逸+丁小娟

摘要：通过单因素试验优化了影响乙醇-硫酸铵双水相提取鱼腥草（Herba houttuyniae）总黄酮提取率的因素，进一步通过正交试验确定了各因素的影响程度，顺序为乙醇浓度>提取温度>提取时间>料液比。优化后的提取条件为脱脂鱼腥草粉末2.0 g，乙醇用量32.50%（w）、硫酸铵16.00%（w）、料液比1∶15、提取温度60 ℃、提取时间30 min，在该条件下，鱼腥草总黄酮提取率为3.16%。

关键词：鱼腥草（Herba houttuyniae）；双水相；总黄酮；提取工艺

中图分类号：R284.2 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2017）24-4844-03

鱼腥草（Herba houttuyniae）为三白草科蕺菜属多年生草本植物，其具有抗菌、抗病毒、抗炎、抗过敏、抗肿瘤等多种药理作用，还可增强机体免疫功能[1，2]。鱼腥草含有多种活性成分[3，4]，如挥发油、阿福豆甙、金丝桃甙及蕺菜碱，黄酮类成分有斛皮素、斛皮苷、绿原酸、金丝桃苷等。鱼腥草活性成分的提取，尚无统一的方法，常见的提取方法[5]有水煎煮法、醇提取法、索式提取法及超声波提取法等，但鲜见采用双水相体系提取鱼腥草黄酮的文献报道。近年，双水相萃取（Aqueous two-phase，ATP）技术因设备投资少，操作简单，引起了人们极大的关注，并且被广泛用于生物化学、细胞生物学和生物化工等领域[6]。基于与水互溶的有机溶剂和盐水相的双水相萃取体系具有价廉、低毒、较易挥发等特点。

本试验应用乙醇-硫酸铵双水相体系提取鱼腥草中主要成分总黄酮，以总黄酮提取率为指标，采用单因素试验和正交试验法，考察提取溶剂浓度、料液比、提取时间及提取温度等对总黄酮提取工艺的影响，确定乙醇-硫酸铵双水相体系提取鱼腥草总黄酮的较佳工艺条件，旨在为鱼腥草总黄酮提取工艺的产业化提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

芦丁标准样品（中国药品生物制定检定所， 生化试剂），其他试剂均为分析纯；鱼腥草（药店所售中草药）。

电热恒温水浴箱（北京市永光明医疗仪器厂）、SHZ-D（III）型循环水式真空泵（巩义市予华仪器有限责任公司）、7230G型可见分光光度计（上海菁华科技仪器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 提取方法 称取鱼腥草干细粉（过60目筛）于索氏提取器中，经石油醚脱脂，并除去部分色素。同时，称取2.0 g脱脂后烘干的样品于250 mL碘量瓶中，按一定的料液比加入乙醇-硫酸铵双水相溶液，置于恒温水浴箱中，提取一段时间后过滤，静置分层，将滤液用分液漏斗将两相分开，即得鱼腥草黄酮类化合物提取液，将醇相提取液高速离心25 min后经微孔滤膜过滤，用甲醇定容至250 mL，以供分析测试用。

1.2.2 分析方法 鱼腥草中黄酮类化合物含量的测定参照文献[7，8]的方法，以芦丁为标样测定鱼腥草黄酮类化合物的含量，所得标准曲线回归方程为Y=0.093 8A+0.000 1，式中，Y为芦丁质量浓度（g/mL），A为吸光度，相关系数R?=0.999 7。

取2.5 mL样品溶液至25 mL容量瓶中，加5%（w）的NaNO2 1 mL，摇匀，放置5 min后加入10%（w）的Al（NO3）3 1 mL，5 min后再加入4%（w）的NaOH 10 mL，摇匀，用去离子水稀释至刻度，10 min后于7230G型分光光度计上在510 nm处测定吸光度A（以试剂为空白参比），根据芦丁标准曲线回归方程，得到提取液浓度，总黄酮提取率按照下式计算：

Et=（C×V×D）/W×100%

式中，Et为总黄酮提取率，C为测得的提取液浓度，V为提取液醇相体积，D为稀释倍数，W为原料的质量。

1.2.3 正交试验 在单因素考察的基础上，采用L9（34）正交表进行了正交试验（表1）。

2 结果与分析

2.1 乙醇溶液浓度对鱼腥草总黄酮提取效果的影响

在温度为40 ℃，固定硫酸铵用量6.4 g（16.00%），脱脂鱼腥草粉末2.0 g，料液比1∶20，提取时间30 min的条件下，考察了乙醇溶液浓度对鱼腥草总黄酮提取率的影响，结果如图1所示。由图1可知，在硫酸铵用量一定的情况下，随着乙醇溶液浓度的增加，总黄酮提取率逐渐增加，当乙醇溶液浓度达到32.50%时，提取率达到最大。此后，随着乙醇溶液浓度的增加，总黄酮提取率显著下降。其主要原因可能是，乙醇溶液浓度过低不利于黄酮的浸出，随着乙醇浓度增加，双水相体系的分相能力增加，乙醇在上层的体积也逐渐增加，黄酮溶解度增加，一些脂溶性有机物的溶出量也会增加，抑制了总黄酮的浸出。因此，确定合适的乙醇溶液浓度为32.50%。

2.2 料液比对鱼腥草总黄酮提取效果的影响

在温度为40 ℃，硫酸铵用量16.00%，乙醇溶液浓度为32.50%（r=0.667），提取时间30 min的条件下，考察了料液比对鱼腥草总黄酮提取率的影响，结果如图2所示。由图2可知，在硫酸铵和乙醇用量比例一定的情况下，随着料液比的增加，总黄酮的提取率逐漸增加，当料液比为1∶20时，提取率达到最大。此后，随着料液比的增加，总黄酮提取率开始降低。原因可能是，料液比较小时，溶剂渗透并扩散到细胞内的速度以及黄酮化合物向溶剂中扩散的速度小，如果料液比较大时，虽然有利于溶剂进入细胞内破坏疏水键，利于黄酮化合物向溶剂中扩散，但会耗费大量的溶剂和硫酸铵。因此，确定合适的料液比为 1∶20较好。

2.3 提取时间对鱼腥草总黄酮提取效果的影响

在温度为40 ℃，硫酸铵用量16.00%，乙醇溶液浓度为32.50%（r=0.667），料液比1∶20的条件下，考察了提取时间对鱼腥草总黄酮提取率的影响，结果如图3所示。由图3可以看出，鱼腥草总黄酮提取率在20～50 min时随着提取时间的延长而升高，当提取时间为50 min时，提取率达到最大，继续延长提取时间总黄酮提取率反而下降，原因可能是，在提取初期，鱼腥草中的总黄酮不断浸出，随着提取时间的延长，总黄酮的浸出率逐渐达到最大。如果继续延长，乙醇挥发量增加，会引起黄酮提取率降低。因此，确定合适的提取时间为50 min。endprint