高危型HPV DNA整合致宫颈癌的机制及检测进展

梁 银，张守桃

（右江民族医学院，广西 百色 533000）

宫颈癌指的是发生在宫颈部与子宫颈阴道的一种恶性肿瘤，属常见妇科肿瘤，发生率仅次于乳腺癌。在近30年，宫颈癌发病率每年上升0.6%，全世界每年有20万人因宫颈癌死亡，国内每年将近5万人因为宫颈癌而死。根据病理学描述性的诊断方法把宫颈癌前病变划分成高度鳞状上皮内病变（HSIL）与宫颈癌前病变分为低度鳞状上皮内病变（LSIL），也就是浸润性宫颈癌（ICC）、宫颈上皮内瘤变（CIN）与宫颈原位癌等。

1 HPV的整合位点

通常病毒整合的位置经常会随机产生，倾向E1、E2、E4、E5区，上述区域区域被侧翼宿主细胞中DNA所中断。魏文斐[1]等人经收集数个国内外的研究，得出一共有400次整合的事件。梁洁琼[2]等人于49个宫颈癌的样本中找出117个独立的整合位点，这些整合位点横跨整个病毒的基因组。通常情况下，病毒整合发生在人类基因组内含子以及编码基因的密集区域，例如：转录活性区、致癌基因以及普通脆性位点。高危型HPV DNA一般整合至染色体之中，只有部分会整合至线粒体上，除了9、18、22号染色体以外，其他都有整合的位点。

2 HPV整合可能致癌机制

2.1 宿主的染色体异位与重排

病毒基因的整合会致使宿主染色体出现变化，主要包含非染色质损害、染色体易位与缺失，一直到染色体发生重拍。高冬梅[3]等人研究中指出，将近33%整合位点出现基因的重排，HPV DNA病毒整合与基因组重排间有着高度的相关性。在宫颈癌的细胞系之中，HPV DNA整合在细胞核中的染色体上，会使得E6、E7的基因出现过度表达，引起中心体出现异常的扩增，对细胞周期的有丝分裂保真度进行破坏，导致非整倍体与染色体异常风险加大，属于结构染色体的不稳定性与DNA破坏主要源头。如果发生染色体易位，会使得基因发生断裂，原癌的基因和其他基因会重新结合成融合基因，引起过表达，导致抑癌基因的功能受到影响。

2.2 致癌基因的激活以及抑癌基因的失活

癌症发展与发生是各类遗传学功能与结构改变后，出现致癌基因的激活以及抑癌基因的失活所致。pRb与p53抑癌基因能够对细胞周期进行调节，在E2F的转录因子作用下，可以激活pRb，对细胞凋亡进行调节。HPV16中E7与E6产物分别会和pRb、p53结合，然后生成相应的复合体，从pRb-E2F的复合体中E2F会解离为游离态，降解p53以及pRb，导致细胞周期的调节失控，致使细胞停滞在G1期进入到无限的增殖。E6的癌蛋白也可以对c-myc的基因表达进行调节，富含GC区SP1结合位点与cis元素myc基因过表达联合诱导hTERT上调基因表达，对细胞的增殖能力与染色体稳定性产生破坏，导致角质细胞永生化，所以端粒酶既是一个筛选癌症的标志物，又是癌症治疗的靶点。c-myc的基因主要处在染色体8q24.1的位置，经过识别与结合靶序列之中CACGTG的核心序列，可以使得转录增强或是激活靶基因，经顺式作用可以将生长抑制基因对于细胞的无限增殖能力抑制解除，使得细胞永生化，并且会在HPV16/18中出现高度表达，能够当作宫颈癌的诊断以及预后治疗评估指标。

3 分析高危型HPV DNA整合状态检测的方法

3.1 分析DIPS-PCR的技术

连接介导（ligation-mediated）的PCR技术能够对整合乳头瘤的病毒序列进行检测，用在HPV永生化角质细胞系的基因组病毒于扩增HPV相关宫颈癌细胞系细胞内的连接体，与测序方法相结合，能够对染色体进行检测，能够用作病毒早期的整合阶段检测方式。

3.2 分析MLPA的技术

多重连接依赖式探针扩增（MLPA）是在PCR、杂交与连接基础上，于单一反应管内对四十个不同核苷酸靶序列拷贝数变化进行同时检测，定位定量分析待测核苷酸的一种新技术。主要优势是操作比较简单、高通量、重复性好、灵敏度高于特异性高，在染色体的数目异常检测中比较常用，可以用于甲基化、基因片段的缺失与重排中检测。孙晓娟[4]等人通过MLPA技术对HPV16/18病毒载量与生理状态进行同时检测，研究结果得出MLPA的技术有着较高的敏感性。然而，因为其扩增为待测的探针，不属于靶序列，因此不可以用在染色体的易位检测与单个细胞的核苷酸检测中。

3.3 分析APOT的方法

乳头瘤病毒致癌基因的转录子扩增法（APOT）方法，主要把mRNA的转录体当作基础，可以对游离体起源病毒转录体以及整合起源融合转录体进行识别，对RNA实施测序、逆转录以及PCR的扩增，对HPV中游离转录体进行分析，以便对病毒生理的状态进行鉴定。APOT的技术既可以对病毒的生理状态进行鉴定，又可以对E6与E7的致癌基因病毒整合具体位点与表达水平进行深入研究，相较于实时定量的PCR技术，其敏感度比较该，然而这种技术只可以对短RNA的转录体进行检测，细胞中需要具备游离的转录体才可以扩增，其应用范围比较狭窄。

3.4 测序技术与杂交捕获法

杂交捕获方法（HC）主要是按照高危型DNA的全基因组文库来设计捕获的探针，在DNA文库与捕获探针杂交以后，通过链霉素亲、生物素吸附素磁珠吸，没有捕获DNA被洗脱，并且洗脱DNA中如果存在整合位点，会继续实施测序与PCR扩增，获得病毒整合的染色体图谱。H属于唯一获得FDA批准分型检测HPV方法，能够对13种的高危型HPV进行检测，结合测序方法，可以检测整合位点与分型，是现阶段HPV检测的一种较好方式。朱义保[5]等人应用这种技术一共发现110多个整合位点，相较于DIPS-PCR的技术，其敏感度比较高。但是因为该技术花费比较高，对于设备要求相对较高，导致基层普及的难度比较大。

4 结 论

总之，HPV疫苗包含医疗性与预防性的疫苗，其中预防性的疫苗把L1、L2当作靶抗原，可以在细胞表面组装为病毒样颗粒（VLPs），类似于天然病毒的颗粒结构，免疫原性比较高，可以引起棘突特异性局部免疫与抗体的反应，避免机体受到HPV的感染。因此，在临床上，经过准确筛查HPV，能够给临床治疗与预后提供保障。

[1] 魏文斐,苏桂栋,吴兰芳.宫颈癌与癌前病变组织中HPV-16的整合感染状态[J].南方医科大学学报,2015,23(1):47-50.

[2] 梁洁琼,赵 敏.高危型人乳头瘤病毒整合态与宫颈上皮内瘤变及宫颈癌关系的探讨[J].中国药物与临床,2014,14(4):431-433.

[3] 高冬梅,龙 梅,张 璐.新疆维吾尔族宫颈癌组织中 HPV-DNA 表达及存在状态的研究[J].新疆医科大学学报,2014,11(7):837-840.

[4] 孙晓娟,王 健.人乳头瘤病毒16的整合作用在不同宫颈病变组织中的表达及意义[J].中国综合临床,2017,33(1):18-21.

[5] 朱义保,谢 彤,杨亮亮.人乳头瘤病毒HPV16整合与宫颈病变程度的研究[J].实验与检验医学,2015,21(4):395-398.