白鹤芋花序体细胞胚胎发生诱导研究

张桂芳+刘静+刘春+张黎

摘要：以白鹤芋的花序为外植体，研究不同外源激素浓度、外植体的不同发育时期、花序取材部位及不同光周期培养条件对花序体细胞胚诱导的影响，拟筛选出体胚诱导的最佳培养基配方及培养条件。结果表明，最优白鹤芋花序体胚诱导方案如下：以白鹤芋盛花期花序为外植体，用0.1%氯化汞溶液灭菌10 min，接种于MS+5.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L TDZ+0.1 mg/L NAA培养基中，黑暗培养15 d后转到光—暗周期为12 h—12 h的条件下培养。

关键词：白鹤芋；花序；体细胞胚；体胚诱导

中图分类号： Q945.51文献标志码： A文章编号：1002-1302（2017）23-0038-03

收稿日期：2016-07-06

基金项目：宁夏科技支撑计划项目子课题（编号：GIP201648）。

作者简介：张桂芳（1988—），女，山西大同人，硕士研究生，主要从事观赏植物研究。E-mail：544406790@qq.com。

通信作者：张黎，教授，主要从事观赏园艺研究。E-mail：zhang_li9988@163.com。白鹤芋（Spathiphylium）别称苞叶芋、白掌、和平芋，为天南星科白鹤芋属多年生草本花卉。白鹤芋广泛应用于盆栽观赏，被视为“清白之花”，有纯洁、安泰、一帆风顺之意[1]，是理想的花叶兼赏花卉，深受广大消费者的喜爱，其市场需求量逐年增加，白鹤芋主要通过组织快繁技术来满足其市场需求。体细胞胚胎繁殖技术是组织培养中一種高效的快繁技术，对于白鹤芋的组织培养，多集中在其器官发生，关于其体胚诱导的研究较少，最早的是周丽侬等于1995年对花序体胚再生途径的研究[2]。本试验以白鹤芋花序为外植体，研究花序取材时期、取材部位及激素浓度等对体胚诱导的影响，以期为白鹤芋的体胚诱导提供依据。

1材料与方法1.1试验材料

以白鹤芋品种美酒的花序为外植体材料，取自宁夏银川市宁夏园艺产业园。

1.2试验方法

1.2.1不同发育时期白鹤芋花序灭菌处理试验设不同白鹤芋花序发育时期的处理，分别为花苞期（即初花期，佛焰苞被完全包裹）（图1-A）、盛花期（佛焰苞完全开放）（图1-B）、末花期（佛焰苞及花序转为绿色）（图1-C）。将外植体用自来水冲洗30～60 min后，用75%乙醇处理30 s，然后用无菌水冲洗2～3遍，再然后用0.1% HgCl2溶液分别处理8、10、12 min，最后用无菌水冲洗2～3遍。将处理后的花序接种于不添加激素的MS培养基中，每个处理设20个外植体，试验重复3次。接种20 d后，统计污染率，30 d后统计褐变率、无菌体获得率。

1.2.2白鹤芋花序体细胞胚胎诱导试验白鹤芋体细胞胚胎的诱导培养基选择6-苄氨基腺嘌呤（6-BA）、噻苯隆（TDZ）和萘乙酸（NAA）3种激素，设3个水平（表1）进行正交试验，共9个处理（表2），每个处理20瓶，试验重复3次。以MS为基本培养基，附加30 g/L蔗糖，6 g/L琼脂，pH值58。将灭菌后成活的花序横切为1.0～1.5 mm的薄片，接种于培养基中进行培养，每瓶接种5个。培养50 d后，统计体胚诱导率及体胚的生长情况。

1.2.4光周期对花序体胚的诱导试验在不同光周期条件下进行体胚诱导试验，设3种方式：T1处理，黑暗条件下培养15 d后，转到光—暗周期为12 h—12 h的条件下培养；T2处理，始终在光—暗周期为12 h—12 h的条件下培养；T3处理，全暗条件下培养。在确定最佳体胚诱导培养基后，将花序接种到最佳体胚诱导培养基中培养，培养20、30、40、50、60 d后观察并统计褐变率、诱导率。每个处理20瓶，重复3次。

1.2.5数据统计及处理相关公式如下：

污染率=（污染的花序数/接种的花序外植体总数）×100%；

褐变率=（发生褐变的花序数/接种的花序外植体总数）×100%；

无菌花序获得率=[（接种的花序总数-污染的花序数-死亡的花序数）/接种的花序外植体总数]×100%；

体胚诱导率=（生成初级体胚花序数/接种的花序外植体总数）×100%。

采用DPS软件对数据进行处理，采用Duncans新复极差法进行多重比较。

2结果与分析

2.1灭菌处理对不同发育时期白鹤芋花序污染率的影响

用0.1% HgCl2溶液对白鹤芋花苞期、盛花期、末花期花序进行不同时间的灭菌试验。如表3所示，当花苞期的灭菌时间为8 min时，无菌花序获得率最高，为50.34%。盛花期花序在灭菌时间为10 min的处理下，污染率为26.67%，无菌花序获得率达64.44%，即最适宜的灭菌时间为10 min。末花期最适宜的灭菌时间为12 min，其无菌花序获得率达4778%。各个花期的褐变率都随着灭菌时间的增加而提高，且在相同的灭菌时间下，褐变率排序为花苞期>盛花期>末花期。综合比较褐变率和无菌花序获得率可知，盛花期在最适宜的灭菌时间下，无菌花序获得率最高，花苞期次之。

2.2不同激素浓度对初级体细胞胚直接诱导的影响

在初级体胚诱导培养过程中，9个处理的培养基都能诱导初级体胚的产生，但不同培养基中的初级体胚诱导率差异较大。处理1、处理2、处理3培养基中的花序在培养40 d后大部分都出现褐化及死亡的情况，只有极少部分花序能产生微小的黄绿色颗粒状突起。随着6-BA浓度的增加，处理 4至处理9在培养10 d后白色的花序均逐渐转为绿色，并膨大。培养50 d后花序膨大至原来的2倍，处理4、处理5、处理6表面产生少量的黄绿色体胚，处理8花序表面形成大量紧密的簇状体细胞胚。在解剖镜下观察，可清晰地看到黄绿色的球形胚（图2-B）、梨形胚（图2-C）、子叶形胚（图2-D）和成熟体胚（图2-E），在同一个花序上能观察到不同发育时期的体胚（图2-A）。endprint

9个处理间差异都极显著，由K值和诱导率可知，处理8为白鹤芋花序初级体细胞胚诱导的最佳培养基，激素组合为5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L TDZ+0.1 mg/L NAA。由极差R可知，6-BA 对白鹤芋花序初级体胚诱导的影响最大，远大于TDZ、NAA，3种激素对初级体胚诱导效应大小依次为 6-BA>TDZ>NAA（表4）。

2.3白鹤芋花序不同发育时期、不同取材部位对初级体细胞胚诱导的影响

由表5可以看出，花序体胚诱导率与发育时期、取材部位具有一定的相关性，体胚诱导率排序为盛花期>初花期>末花期，且盛花期体胚的诱导率明显高于其他时期。同时期同花序的不同形态位置对体胚诱导有显著影响，表现为花序下端>花序上端>花序中端。其中盛花期花序形态学下端的诱导率最高，达71.67%，且与其他处理差异极显著。综合体胚

2.4光周期变化对体细胞胚诱导的影响

由表6可知，3个处理均能诱导出体细胞胚，但各处理间差异显著。T1、T2处理较T3处理诱导率高， 生成体细胞胚数

量多。但在T3处理培养条件下，褐变率较T1、T2处理低。花序体细胞胚的诱导在黑暗培养条件下较光照条件下晚，60 d时，花序在光—暗条件下的胚诱导率比在全黑暗培养下的体胚诱导率提高了20%以上。在体胚发育过程中观察发现，培养至20 d时部分花序上生成颗粒状突起，随着培养时间增加，颗粒状突起逐渐膨大。当培养到60 d时，T2处理体胚呈淡绿色略显褐色，T3处理体胚呈黄白色，T1处理体胚呈黄绿色，随着培养时间的增加，T1处理体胚颜色逐渐变绿，且最为健康。因此可以得出，T1处理是体胚诱导最佳的光周期变化。

3结论与讨论

3.1结论

对于不同发育时期的白鹤芋花序，用0.1%氯化汞溶液进行灭菌处理可知，花苞期最佳灭菌时间为8 min，盛花期最佳灭菌时间为10 min，末花期最佳灭菌时间为12 min。在最佳灭菌时间下，无菌花序获得率由高到低依次为盛花期>花苞期>末花期。

白鶴芋花序体胚诱导的各激素效应大小依次为6-BA>TDZ>NAA，其中6-BA的影响最显著。9个处理的培养基中，体胚诱导率差异较大，花序初级体细胞胚诱导最优激素组合为 5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L TDZ+0.1 mg/L NAA。

盛花期的花序为最佳体胚诱导外植体，而且以盛花期的形态学下端的体胚诱导率最高。黑暗下培养15 d后转到光—暗周期为12 h—12 h条件下培养为白鹤芋花序初级体胚诱导的最佳培养条件。

3.2讨论

同一植物的不同发育时期及不同部位对外植体的灭菌效果具有一定的影响。高亦珂在试验中指出，百合鳞茎、鳞片灭菌效果排序依次为内部>中部>外部[3]。百合内部和中部鳞片被包裹，受到外界环境的污染小，因此灭菌效果较好。本研究在对白鹤芋不同发育时期花序进行灭菌处理试验中发现，白鹤芋花序的花苞期、盛花期的灭菌效果比末花期灭菌效果好。这是因为花苞期的花序轴被苞片包裹，盛花期的花序苞片展开时间不长，受外界环境影响程度小，而末花期的花序轴完全暴露，受外界环境影响大，易受损伤和受到细菌的侵染，灭菌难，污染率高。

在白鹤芋体细胞胚诱导培养中，MS培养基只保证白鹤芋花序的生存，只有生长素及细胞分裂素浓度适宜的配比，才能诱导产生形态正常、数量多的体细胞胚。体胚的诱导通常需要较高浓度的细胞分裂素和较低浓度的生长素或不需要生长素[4-5]。周丽侬等研究认为，含有高浓度6-BA的培养基有利于白鹤芋花序体细胞胚的直接诱导[2]。曹静等通过研究得出，白鹤芋幼嫩花序培养在MS+4～5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA的培养基中，由花序表面直接发生体细胞胚胎[6]。邝哲师等研究发现，高浓度的6-BA有利于提高香蕉花序体胚直接发生频率[7]。吕秀立等研究表明，诱导欧洲七叶树体细胞胚产生的最佳培养是8 mg/L 6-BA+1 mg/L NAA+2 mg/L 2，4-D+0.2 mg/L KT[8]。白鹤芋花序直接体胚诱导率与发育时期、取材部位具有一定的相关性。穆红梅等以中国石蒜花苞期、盛花期、落花期的花序轴为外植体进行组织培养研究表明，花序在不同发育时期对中国石蒜不定芽产生有显著影响，盛花期产生的花序轴不定芽数量最多[9]。王丽等在对香雪兰花序直接体细胞胚胎发生的试验中发现，诱导产生的体细胞胚都出现在花序轴切段的原形态学下端。上述研究结果与本试验一致[10]。光周期的不同对胚状体形成有显著影响，在每天光照14～16 h与黑暗8 h～10 h交替条件下体胚直接诱导效果最佳[11]。邝哲师等研究发现，黑暗培养对香蕉体胚直接发生有促进作用，黑暗条件抑制了外植体本身酚类物质的氧化，减少了醌类物质形成产生的毒害[7]。

范国强等研究表明，悬铃木外植体在黑暗条件下培养3 d后，再放置在光照时间为16 h/d的条件下培养，不仅可以促进悬铃木体细胞胚胎的发生，而且提高了体胚诱导率[12]，与本试验结果一致。

参考文献：

[1]于丽萍. 花叶俱美的室内植物——白掌[J]. 绿化与生活，2002（2）：28.

[2]周丽侬，曹静，邝哲师，等. 园艺植物体胚发生及植株再生技术研究[J]. 热带作物学报，1998，19（2）：15-19.

[3]高亦珂. 几种百合组织培养及体细胞胚发生技术的研究[D]. 北京：北京林业大学，2009.

[4]Centeno M L，Rodrigue R，Berros B，et al. Endogenous hormonal content and somatic embryogenic capacity of Corylus avellana L. cotyledons[J]. Plant Cell Reports.1997，17（2）：139-144.

[5]杨映银，桂耀林，郭仲探. 裸子植物体细胞胚胎发生和人工种子的研究[J]. 种子，1995（3）：25-30

[6]曹静，周丽侬，邝哲师，等. 白鹤芋花序体细胞胚胎发生及植株再生研究[J]. 农业生物技术学报，1995，3（3）：81-85.

[7]邝哲师，周丽侬，马雪筠，等. 香蕉和荔枝体胚发生两种不同途径的研究（简报）[J]. 农业生物技术学报，1998，6（3）：210.

[8]吕秀立，施季森. 欧洲七叶树体细胞胚胎发生研究[J]. 分子植物育种，2003，1（5）：649-654.

[9]穆红梅，夏冰，汪仁，等. 以花序轴为外植体的中国石蒜的组织培养研究[C]//中国观赏园艺研究进展，2014：280-284.

[10]王丽，鲍晓明，黄百渠，等. 香雪兰外植体形态学极性决定的体细胞胚胎发生[J]. 植物学报，1998，40（2）：138-143.

[11]Martin K P，Madassery J. Direct and indirect somatic embryogenesis on cotyledon explants of Quassia amara L.，an antileukaemic drug plant[J]. In Vitro Cellular & Developmental Biology-Plant，2005，41（1）：54-57.

[12]范国强，黎明，贺窑青，等. 悬铃木体细胞胚胎发生及植株再生[J]. 林业科学，2004，40（3）：71-74.江苏农业科学2017年第45卷第23期郭建军，曾静，袁林，等. 多角体包裹型猪α干扰素在昆虫细胞中的表达[J]. 江苏农业科学，2017，45（23）：41-44.endprint