三维组织药敏法在肿瘤个体化精准医疗中的应用

纪 巧 陈 丽 综述 何远桥 审校

2017年2月，国家癌症中心公布了2013年中国恶性肿瘤的发病和死亡数据，与2012年相比，癌症新发病例数持续上升，从358万增加到368万，增幅达到3%，占世界新发病例(约1 409万)的1/4，每天约有1万人确诊为癌症[1]。传统恶性肿瘤的治疗手段包括放疗、化疗、免疫治疗、中药等，其中化疗大多采用美国国立综合癌症网络(National comprehensive cancer network，NCCN)指南推荐的标准化疗方案，忽略了肿瘤内在固有的异质性，比如：一项经典的Ⅲ期临床试验研究发现，多西紫杉醇、顺铂和氟尿嘧啶三联化疗方案治疗晚期转移性胃癌的客观有效率仅为57.7%，并具有严重的毒副反应[2]。然而，实现“个体化精准医疗”却能有效地解决传统治疗手段的针对性低、毒副作用明显、药品无效耗费率高等问题[3]。个体化精准医疗(Individualized precision medicine)的本质是利用医学前沿技术或基因组、蛋白质组等组学技术，实现个体化精准治疗的目的，提高疾病诊治与预防的效益[4-5]，由于三维组织药敏法(Histoculture drug response assay，HDRA)能有效地预测化疗药物敏感性、耐药性，所以HDRA是实现个体化精准医疗的重要手段之一[6]。

肿瘤药敏试验方法可以预测患者对不同化疗药物的敏感性，实现患者的个体化精准给药，它是个体化精准医疗的核心内容之一[7-9]。肿瘤药敏试验方法共分为体内、外两大类，体外药敏实验包括3-(45-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)法、三磷酸腺苷(ATP-TCA)法、胶原凝胶液滴培养(CD-DST)法、流式细胞仪法、细胞凋亡法、乳酸脱氢酶(LDH)检测、HDRA等。其中，大多数的体外药敏试验本质是单层细胞培养药敏法，难以模拟原肿瘤组织的异质性及再现肿瘤微环境。HDRA是20世纪80年代末出现并不断被改进和发展的一种体外药敏实验方法[10]，它不仅实验周期短，还维持了肿瘤组织三维的生长方式、组织结构、细胞异质性和致瘤性等多种体内特性，可模拟细胞外基质、细胞间相互黏附作用、信息传导等，更接近于体内和临床的实际情况[11-15]。因此，本文就HDRA在肿瘤个体化精准医疗中的应用做一综述。

1 HDRA的发展史

1912年，Alexis carrel通过体外低渗血培养鸡胚心脏组织发现，鸡胚心脏组织能长期存活并维持其收缩功能，证明了组织体外培养是可行的[16]。1985年，美国加州大学圣地亚哥分校Hoffman团队证明了肿瘤组织在三维培养的条件下可以长期存活并维持类似体内环境下的组织结构特征，奠定了HDRA检查技术的基础[10]。1987年，Hoffman团队又报道了肿瘤组织在三维培养的条件下检查化疗药物的敏感性与体内肿瘤相似，率先提出了HDRA药敏法可为个别癌症患者筛选有效的抗癌药物[11]。

目前HDRA在肿瘤研究领域中得到了广泛的应用，比如实体肿瘤的药敏检测、新药的开发和筛选等，为使其操作变得更简便、灵敏、可靠，学者们在应用的过程中分别对其做了以下几点改良。首先，研发了多种三维组织块的支持物，比如：网状物、胶原凝胶、明胶海绵等，但目前市场上应用最广泛的是明胶海绵[17]。而且，他们还将最初6孔板改成了24孔板[18]，以便用来检测更多药物。其次，早期HDRA利用H3 TdR放射性自显影技术进行检测，耗时长、费用高、操作复杂，且有辐射，不利于临床推广。现要在HDRA通过利用MTT、MTS、CCK-8法检测，这三种方法都是通过测定吸光度值来间接反映活细胞数目[19]。MTT因价格便宜，使用非常广泛，而MTS和CCK8因实验操作简便、结果稳定等优点应用持续增多[20]。

2 HDRA在各种恶性肿瘤药敏检测中的应用

2.1 HDRA在肺癌药敏检测中的应用

肺癌高居我国恶性肿瘤死亡和发病的首位[21]。Yoshimasu等[22]回顾性分析了359例肺癌患者的HDRA检测结果，发现HDRA可评价率为97.4%，真阳性率为73.2%，真阴性率为100%，敏感性100%，特异性68.1%，准确性达到了83.0%，具有良好的预测性。而高隆等[23]采用了MTT法进行肺癌体外药物敏感性测定，与临床治疗结果符合率为 89.3% ，阳性符合率为 90. 9% ，阴性符合率为77.8% ，试验敏感性为 96.8% ，特异性为 53.8%。两种方法相比，HDRA预测肺癌与敏感性、特异性明显优于MTT法，更有利于肺癌患者的个体化精准治疗。

此外，Yoshimasu团队[24]又对22例非小细胞肺癌患者进行HDRA检测，其中包括16个腺癌患者，4个鳞状细胞癌患者以及2个类癌型患者，他们发现，吉非替尼抑制率与其浓度呈剂量-反应关系。非吸烟组腺癌20 μg/mL的抑制率(39.2%±35.1%，n=6)高于吸烟组腺癌(2.2%±5.0%，n=10，P=0.001)及非腺癌组的抑制率(16.9%±23.6%，n=6，P=0.09)，研究结果认为，HDRA可以评估非小细胞肺癌对吉非替尼的敏感性，但文章同时也指出，肿瘤组织块是离体组织，无血管支持。在理论上，失去血管支持的肿瘤组织预测抑制血管生成的靶向药物的敏感性是不可行的[25]，但实际上，对于HDRA到底能否预测靶向药物的敏感性，还存在着巨大争议，HDRA确切的作用机制也有待于更进一步的研究。

2.2 HDRA在胃肠道肿瘤药敏检测中的应用

目前中晚期胃肠道肿瘤化疗有效性尚不尽人意[26]。运用HDRA预测胃肠道肿瘤辅助化疗药物的敏感性，有利于胃肠道肿瘤的个体化精准治疗，提高胃癌患者的生存期。Hoffman等[27]纳入107例晚期胃癌和109例晚期结直肠癌患者，并检测其对丝裂霉素C、多西他赛、5-氟尿嘧啶和顺铂的化学敏感性，其中有208例(96.3%)完成了HDRA，但实际上只有38例患者的HDRA结果与临床结果进行了相关性分析，结果表明两者的符合率高达92.1%，真阳性率66.7%，真阴性率100%，敏感性为100%，特异性为90.6%。虽然人肿瘤细胞集落形成测定法可以直接评价细胞增殖死亡，但临床标本检测率低[28]，而HDRA临床检查检测成功率高达96.3%。上述表明HDRA能有效预测胃肠道肿瘤术后辅助化疗药物的敏感性和耐药性，根据其结果指导治疗，有利于胃肠道肿瘤的个体化精准治疗。此外，术前新辅助化疗可以提高胃肠道癌根治性手术的切除率[29]，未来，HDRA是否同样可用于预测术前新辅助化疗药物的敏感性，需要更多的深入研究。

2.3 HDRA在乳腺癌药敏检测中的应用

乳腺癌已经成为全球女性发病率和死亡率的首要病因[30]。Tanino等[31]研究共纳入24例复发乳腺癌患者和127例原发乳腺癌，比较使用多种化疗药物对原发乳腺癌及复发乳腺癌的抑制率。顺铂，5-氟尿嘧啶和丝裂霉素C作为测试药物，原发乳腺癌与复发乳腺癌在HDRA检测中均加入丝裂霉素C的抑制率分别为59.9%和42.8%；加入5-氟尿嘧啶的抑制率分别为49.0%和33.4%；加入顺铂的抑制率分别为34.5%和16.0%，平均抑制率分别为57.9%和38.6%，其中复发乳腺癌有64.7%对4种药物均耐药，而原发乳腺癌仅有27%，另外，复发乳腺癌仅有5.9%的患者对三种或多种药物敏感，最后分析了所有患者的HDRA结果与临床结果，发现临床相关性为80.0%。因此，运用HDRA可以为临床决策特别是可以为克服复发乳腺癌多药耐药性问题提供个性化的指导。

另外，专家们已经公认化疗联合内分泌治疗能明显延长乳腺癌等多种内分泌恶性肿瘤患者的生存期，那么，HDRA是否也可以用来预测内分泌药物的敏感性？笔者认为，这是一个非常值得做深入研究的“热点”。

2.4 HDRA在头颈部肿瘤药敏检测中的应用

头颈部肿瘤是全球第六大常见恶性肿瘤[32]，手术联合放疗、化疗等是其主要治疗手段[33]。HDRA可以预测头颈部肿瘤对化疗药物的敏感性。Singh等[34]运用HDRA来预测头颈部鳞状细胞癌的生存期，该研究共纳入42例患者，其中41例患者成功完成了HDRA，研究结果显示有13例患者(32%)对5-氟尿嘧啶耐药，13例患者(32%)对顺铂耐药，11例患者(27%)对两种药物均耐药。同时也比较了耐药的患者和敏感的患者之间的2年生存率，其结果具有统计学差异，5-氟尿嘧啶敏感组与耐药组2年生存率分别为85%vs. 64%，顺铂敏感组与耐药组2年生存率分别为86%vs. 64%，对这两种药物均敏感组与耐药组2年生存率为85%vs. 63%。以上研究表明，HDRA对预测头颈部肿瘤的临床相关性高达70%以上。HDRA优点在于具有较高的成功率，有利于敏感性及耐药性的比较研究，且与头颈部肿瘤临床相关性高。HDRA缺点为忽视头颈部恶性肿瘤不同病理类型之间是存在内在固有的差异性的，比如，头颈部肿瘤包括了鼻咽癌，鼻咽癌的治疗以放化疗为主，一般不主张进行手术切除治疗[35]，导致获取肿瘤组织比较困难。

总之，HDRA在头颈部肿瘤中的应用，可根据其病理、部位等相关结果进行更加细化的分类研究，因此，未来还有很多工作需要我们去完成。

2.5 HDRA在其他肿瘤药敏检测中的应用

除上述肿瘤以外，HDRA也指导子宫内膜癌、卵巢癌、食管癌、膀胱癌等多种恶性肿瘤患者的个体化精准治疗。且不同类型的肿瘤与临床相关性如下：子宫内膜癌93%[36]，卵巢癌97%[37]，食管癌89.3%[13]，膀胱癌80%[37]。

3 HDRA的局限性与未来的发展趋势

HDRA在肿瘤个性化精准医疗中的应用还存在一定的不足。首先，HDRA需要较大体积的肿瘤组织(约1 cm3)，但很多肿瘤在早期组织较小或者手术可切除率不高，无法获取足够量的组织进行检测[38]。其次，HDRA也并非适用于任何肿瘤，如肾癌、前列腺癌、肝癌等多种恶性肿瘤对化疗药物普遍不敏感，这导致HDRA的临床应用受到限制。再者，HDRA对靶向药物特别是抑制血管生成的靶向药物的研究，在理论上是不可行的，但是，有研究检测了抑制血管生成的靶向药物的敏感性，其结果呈阳性，它的作用机制仍有待于做进一步的研究。最后，内分泌药物是用来治疗内分泌肿瘤非常重要的方法之一，HDRA除了可用于预测化疗药物的敏感性和耐药性之外，未来还能否用于预测内分泌药物的敏感性和耐药性，值得我们做进一步的探索和研究。

为了更好地发挥HDRA检测技术的优势，有研究者将HDRA联合了其他技术方法，以此来取长补短。首先，HDRA联合人源性肿瘤组织异种移植(Patient-derived xenograft，PDX)模型。利用穿刺活检等方法，获取少量肿瘤组织，接种免疫缺陷小鼠体内成瘤，待肿瘤组织扩增后，再进行HDRA检测，以期为临床个体化药敏方案的筛选和新药的研发作服务。Delyon等[18]完成了2例黑色素瘤PDX-HDRA实验，他们发现，PDX-HDRA和PDX模型的体内药敏法都对鼠类肉瘤滤过性毒菌致癌同源体B1(BRAF)和丝裂原活化蛋白激酶激酶(MEK)抑制剂有着显著应答，都与临床患者靶向治疗反应一致。其次，HDRA联合qPCR、Western blot技术，能有效地预测肿瘤个体化的生物标记物，比如，中国学者袁庶强利用HDRA联合qPCR、Western blot分析了结直肠癌化疗敏感性与多药耐药基因蛋白表达之间的关系[39]。最后，HDRA也联合了其他更多的技术，比如2个HDRA组成ITRA、HDRA联合类器官、HDRA联合代谢组学等，关于HDRA联合其他技术方法，还有很多可能需要我们去探索与研究。

4 小结与展望

HDRA与传统的二维细胞培养药敏法相比具有明显的优势，但HDRA内在固有的局限性，限制了其在肿瘤领域的广发应用。随着HDRA检测方法的不断发展完善及联合其他技术方法，在肿瘤领域必将得到广泛应用，同时，有望在肿瘤个体化化疗方案的筛选中发挥关键作用。