Ghrelin基因在藏猪胃底组织中的mRNA表达

任子利　高卓然　李瑜鑫

摘要：为分析Ghrelin基因在藏猪与长白猪胃底组织中mRNA的表达差异，运用实时荧光定量PCR技术，对Ghrelin基因在藏猪与长白猪胃底组织中mRNA的表达水平进行相对定量检测分析。结果显示，藏猪胃底组织中mRNA的表达量（0.495 8±0.023 1）显著低于长白猪（0.741 7±0.026 6）。说明Ghrelin基因在藏猪胃底组织中mRNA的低表达可能是藏猪生长缓慢的原因之一，这将为提高藏猪生长速度的进一步研究奠定基础。

关键词：Ghrelin基因；藏猪；胃底组织；mRNA表达；PCR技术

中图分类号： Q786文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2017）15-0046-03

藏猪主要生活在我国青藏高原海拔2 500～4 300 m的农区和半农半牧区，是中国特有的能适应高海拔地区的一个重要品种[1-2]，有“高原之珍”的美誉[3]。然而，与长白猪的日增质量达731 g相比，藏猪的生长速度比较缓慢，一般18～30月龄体质量才达50～60 kg，日增质量只有171 g，提高藏猪的生长速度已成为藏猪饲养中的一个关键问题。饥饿激素（Ghrelin）被称为胃饥饿素、生长素或生长激素释放肽，是一种由28个氨基酸组成的多肽，是生长激素促分泌素受体（GHS-R）的一种内源性配体，由日本的Kojima等于1999年从小鼠和人的胃组织中成功分离并鉴定[4]。Ghrelin及其受体在动物体内广泛分布，具有调节生长激素分泌、摄食、能量代谢、生殖等多种生物学作用[5-6]。在猪、羊等动物上已证实，动物摄食可以促进动物生长[7-8]。模拟高原的低压低氧环境可致大鼠血清Ghrelin水平下降，胃黏膜Ghrelin分泌减少，Ghrelin可能参与模拟低压低氧环境中机体消化功能紊乱的调节[9]。然而，关于藏猪胃底组织中Ghrelin基因的mRNA表达水平是否与长白猪有差异，目前未见相关报道。因此，本研究运用实时荧光定量PCR技术，对Ghrelin基因在藏猪与长白猪胃底组织中mRNA的表达进行相对定量检测分析，以探讨藏猪生长缓慢的可能原因，为提高藏猪生长速度的进一步研究奠定基础。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1样本采集及处理

选择生长发育和营养状况正常的6月龄藏猪与3月龄长白猪胃底组织样本各12个（分别取自西藏大学农牧学院实习基地、西藏林芝当地屠宰场），取样后将样本迅速放入RNA样品保存液中，迅速带回实验室进行总RNA的提取或放于-80 ℃冰箱备用。

1.1.2主要试剂与仪器设备

Trizol（碧云天生物技术研究所），Quantscript RT Kit、TransStart Top Green qPCR SuperMix（2×）（天根生物技术有限公司），2xPCRMix（北京百泰克生物技术有限公司）。

PCR仪（德国Eppendorf公司），Boi-Rad凝胶成像系统（美国Bio-Rad公司），CFX96突光定量实时PCR仪（美国Bio-Rad公司），NanoDrop ND-1000紫外分光光度计（美国NanoDrop公司），Eppendorf Centrifuge 5417R、5415R离心机（德国eppendorf公司）。

1.2引物设计与合成

根据GenBank中已公布的猪Ghrelin基因（目的基因）以及β-actin基因（持家基因）的cDNA序列，利用Primer Premier 5.0软件设计定量引物，并送交生工生物工程（上海）股份有限公司合成。2个基因的引物信息见表1。

1.3总RNA的提取与鉴定

利用Trizol一步法，按照该试剂说明书，提取各个样本的总[CM（25]RNA。先用紫外分光光度计测总RNA浓度和纯度，再用1%琼脂糖凝胶电泳确定总RNA的完整性，若RNA的纯度和完整性均符合要求，立即进行反转录或置于-80 ℃条件下保存备用。

1.4反转录cDNA

按照Quantscript RT Kit试剂盒说明书提供的方法，将稀释成同一浓度总RNA的各个样品反转成cDNA，接着进行后续试验或置于-20 ℃条件下保存备用。

1.5基因的PCR扩增

用梯度PCR筛选2对引物的最佳退火温度后，以cDNA第一链为模板，加入引物、dNTP和2xPCRMix等，混匀后进行PCR扩增。反应体系包括反转录产物（cDNA）1 μL、2xPCRMix 10 μL，引物（10 μmol/L）各0.4 μL、ddH2O 8.2 μL，总体积20 μL。PCR扩增反应参数为：95 ℃预变性 5 min；95 ℃变性20 s，58 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，36个循环；72 ℃延伸 5 min，4 ℃结束。1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。

1.6荧光定量PCR

目的基因及持家基因的熒光定量PCR的反应程序为：95 ℃ 15 min；95 ℃ 10 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40个循环；95 ℃ 10 s，65～95 ℃每增加0.5 ℃读取荧光1次，绘制溶解曲线。荧光定量PCR反应采用20 μL反应体系：2X SYBR PCR Buffer 10 μL，cDNA 1 μL，引物（10 μmol/L）各0.4 μL，ddH2O 8.2 μL。目的基因的相对表达量用2-ΔΔCT法计算。

1.7数据统计分析

所得试验数据用SPSS17.0软件进行单因素方差分析，试验结果用“平均数±标准差”表示，P<0.05为差异显著；用Sigmia Plot软件作柱状图。

2结果与分析

2.1总RNA的检测结果endprint

经紫外分光光度仪测定，各个样本总RNA的纯度（D260 nm/D230 nm）均为2.06～2.15，[JP2]琼脂糖凝胶电泳结果如图1所示，可见28S、18S、5S等3条条带。这说明所提取的总RNA纯度和完整性均符合反转录的要求，可以进行反转录试验。

2.2基因的PCR扩增检测结果

由图2可以看出，目的基因与持家基因条带均在恰当位置，后经测序证实这2条条带即为目的基因与持家基因。

2.3实时荧光定量PCR检测结果

藏猪、长白猪胃底组织目的基因Ghrelin及持家基因 β-actin cDNA扩增曲线、熔解峰如图3所示，熔解曲线为单一的峰，说明没有非特异扩增。

[FK（W13][TPRZL3.tif；S+2mm]

Ghrelin相对表达量如图4所示，藏猪胃底组织中mRNA的表达量（0.495 8±0.023 1）显著低于长白猪（0.741 7±0.026 6）。可见，Ghrelin基因在藏猪胃底组织中mRNA的低表达可能是藏猪生长缓慢的原因之一，这将为提高藏猪生长速度的进一步研究奠定基础。

3结论与讨论

Du等的研究结果表明，在仔猪断奶后，其胃底Ghrelin mRNA表达量上调10 d[10]。在体外，半胱胺能显著增加胃黏膜细胞Ghrelin mRNA的表达[11]。Yang等的研究表明，高铜日粮可以通过增强生长猪Ghrelin mRNA的表达水平、生长激素（growth hormone）的分泌来提高采食量、促进体质量的增加[12]；Yin等也有类似的结果，认为仔猪日粮中添加ZnO能刺激其胃中Ghrelin的分泌[13]。而禁食24、48 h均能显著降低大鼠下丘脑中Ghrelin mRNA的表达水平[14]。在禁食72 h后，断奶仔猪下丘脑、垂体、胃中Ghrelin mRNA的表达水平均

较低[15]。在猪、羊等动物上已证实，动物摄食可以促进动物生长[7-8]，本研究结果与之基本一致，即Ghrelin基因在藏猪胃底组织中mRNA的表达显著低于长白猪，这可能是藏猪生长缓慢的原因之一。然而李加龙却得出相反的研究结果，在牦牛皱胃中，Ghrelin阳性细胞分布于黏膜层胃底腺的下部，而瘤胃、网胃和瓣胃上未见其表达，牦牛Ghrelin阳性产物的表达面积（S）和累计光密度值（IOD）均大于黄牛且差异极显著（P<0.01），他认为牦牛胃中的Ghrelin可能以内源性为主，且与外源性相结合共同参与了食欲、摄食行为及能量代谢与平衡等生理功能的调节[16]。这可能与物种等不同有关，若究其原因，尚需进一步研究。

总之，Ghrelin具有调节生长激素分泌、摄食等多种生物学作用，而动物摄食可以促进动物生长。藏猪胃底组织中Ghrelin mRNA的表达量显著低于长白猪，即该基因在藏猪胃底组织中mRNA的低表达可能是藏猪生长缓慢的原因之一，这将为提高藏猪生长速度的进一步研究奠定基础。

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