大孔树脂分离纯化沙枣总黄酮的工艺

兰蓉　刘卉　李浡

摘要：为了确定大孔树脂分离和纯化沙枣总黄酮的工艺条件，以大孔树脂静态吸附量和解吸率为指标，在7种大孔树脂中筛选出分离沙枣总黄酮的最佳大孔树脂型号，采用单因素试验优化这种大孔树脂的吸附、洗脱条件。结果表明，在7种大孔树脂中，XAD7HP型树脂纯化沙枣总黄酮的性能最好，其最佳分离、纯化工艺条件如下：样品质量浓度0.05 mg/mL，上样pH值为4，上样流速为0.5 mL/min，最大上样量为30 mL，洗脱液为60%乙醇，洗脱流速为 0.5 mL/min，最大洗脱体积为40 mL。在所确定的工艺条件下，XAD7HP型大孔树脂能较好地用于沙枣总黄酮的分离纯化，总黄酮的纯度由原来的15.24%提高到了48.77%。

关键词：沙枣；总黄酮；大孔树脂；分离纯化

中图分类号： R284.2文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2017）15-0160-04

沙枣（Elaeagnus Angustifolia L.），别称桂香柳、七里香等，为胡颓子科胡颓子属植物，在我国新疆、青海和宁夏等西北省（区）的栽培面积达13万hm2以上[1]，是民间治疗呕吐和胃胀的传统药方，多用于脾胃虚弱、消化不良、肠炎腹泻、肺热咳嗽等疾病的治疗[2]。据报道，沙枣果实富含黄酮、鞣质、齐墩果酸等功能性成分和营养成分，具有抗氧化、抗肿瘤、免疫调节、抗炎镇痛、抗腹泻和抗疲劳等多种药物用途和营养价值，是西北地区具有开发利用前景的重要资源[3-9]。

近年来，国内外科研工作者对沙枣中的主要功能性成分——黄酮开展了一些研究工作。比如Si等从沙枣树皮中分离得到了儿茶素、表儿茶酸、没食子儿茶素没食子酸酯、表没食子儿茶素、槲皮素和毛地黄黄酮等黄酮类化合物[10]。王基云等研究发现，沙枣花醇提物的总黄酮含量为27 mg/g，能够抑制自由基诱导的肝脏脂质过氧化损伤作用[11]。但是目前仍未有沙枣果黄酮分离纯化的研究报道，所以本试验通过比较7种不同型号的大孔吸附树脂对沙枣果总黄酮吸附性能的差异，探讨分离纯化沙枣果总黄酮的工艺条件，以期为沙枣这一特色资源的开发利用提供试验依据。

1材料与方法

1.1仪器与设备

SHA-C型恒温振荡器（常州国华电器有限公司）；玻璃柱（Ф 1 cm×30 cm，上海琪特分析有限公司）；BT300-2J/YZⅡ25型恒流泵（保定兰格恒流泵有限公司）；SHB-Ⅳ型双循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）；AR2140型电子分析天平（奥豪斯国际贸易有限公司）；LABOROTA 4000型旋转蒸发仪（Heidolph）；UV-1800PC-DSLL型紫外-可见分光光度计（上海美普达仪器有限公司）；PHS-3C型酸度计（上海楚柏仪器有限公司）。

1.2材料与试剂

试验材料：沙枣，购自新疆哈密瓜乡果业股份有限公司。试验试剂：D101型大孔树脂（国药集团化学试剂有限公司）；XAD7HP型大孔树脂（美国罗门哈斯公司）；NKA-2、X-5、NKA-9型大孔树脂（郑州勤实科技有限公司）；HPD100B、AB-8型树脂（河北沧州宝恩化工有限公司）；其他试剂均为国产分析纯。

1.3试验方法

1.3.1大孔树脂的预处理大孔树脂用体积分数95%乙醇浸泡24 h充分溶胀后，湿法装柱，再用体积分数95%乙醇淋洗至流出液与水混合液（体积比1 ∶5）不呈白色为止，然后用大量纯净水洗尽乙醇（无醇味），备用。

1.3.2样品制备[12]取粉碎后的沙枣，加入20倍（质量体积比）的85%乙醇常温浸泡24 h后过滤、减压浓缩、60 ℃干燥，制得干燥浸膏样品。精确称取干燥浸膏2 g，加90 mL水超声处理，使其充分溶解后，将溶液定容至100 mL量瓶中，作为备用液。

1.3.3黄酮含量的测定

1.3.3.1黄酮标准曲線的制备称取芸香苷10.0 mg，用60%乙醇完全溶解，在50 mL容量瓶中定容，得到0.2 mg/mL芸香苷对照品溶液。

精确吸取芸香苷对照品0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL分别置于25 mL容量瓶中，补加蒸馏水使所有容量瓶内液体都在相同刻度线，加1 mL 5% NaNO2，室温放置6 min；加1 mL 10% Al（NO3）3，室温放置6 min；加1 mol/L NaOH 10 mL，用60%乙醇定容至25.00 mL，摇匀后放置15 min，在波长 505 nm 处测各溶液的吸光度。以吸光度（ρ）为纵坐标、浓度（C）为横坐标制作工作曲线，结果得到标准方程为ρ=0.086 9C-0000 6，r2=0.999 9。

1.3.3.2样品黄酮含量的测定称取固体样品100 mg，加入 HCl-乙醇（体积比1 ∶25，HCl、乙醇浓度分别为1%、70%）定容到10.0 mL，超声15 min，取2.0 mL上清液，加 1 mL 5% NaNO2，室温放置6 min；加1 mL 10% Al（NO3）3，室温放置 6 min，加1 mol/L NaOH 10 mL，用60%乙醇定容至25.00 mL，在波长505 nm处测吸光度。

1.3.4树脂的筛选

1.3.4.1树脂含水量的测定称取2 g预处理后抽干水分的大孔树脂，置于80 ℃的干燥箱中干燥至恒质量，根据树脂的湿质量和干质量，用公式Y=（1-m1/m0）×100%计算树脂的含水量。其中：Y为树脂的含水量，%；m1为干树脂的质量，g；m0为湿树脂的质量，g。

1.3.4.2各种树脂静态吸附量和解吸率的测定准确称取5 g各种型号湿树脂（用滤纸吸干表面水分），置于100 mL三角锥形瓶中，加入30 mL配制好的沙枣总黄酮水溶液，在 30 ℃ 下以100 r/min的转速在恒温摇床中振荡2 h，过滤后取样品，通过紫外-可见分光光度法测定过滤液浓度，用以下公式可以计算树脂的静态饱和吸附量、吸附率：endprint

式中：P0为样品液中总黄酮的初始浓度，mg/mL；Pa为吸附平衡后溶液中总黄酮的浓度，mg/mL；Va为样品液体积，mL；m为湿树脂质量，g；Y为树脂的含水量，%。

取上述经静态饱和吸附总黄酮后滤出的树脂，用纯净水冲洗10 min后，用滤纸吸干表面水分，置于锥形瓶中，分别精确加入50 mL体积分数95%的乙醇，用摇床持续振荡5 h后，分别测定洗脱液中总黄酮浓度，按下式计算各型号树脂的解吸率：解吸率=[洗脱液浓度×洗脱液体积]/[（P0-Pa）×Va]×100%。

1.3.5大孔树脂分离纯化沙枣总黄酮的工艺优化

1.3.5.1最佳上样浓度的确定精确称取5.0 g抽干水分的优选树脂，各7份，分别加入30 mL不同质量浓度的沙枣黄酮粗提液，在30 ℃下以100 r/min的转速在恒温摇床中振荡2 h，过滤，测定滤液中黄酮含量，计算吸附率。

1.3.5.2最佳上样pH值的确定精确称取5.0 g抽干水分的优选树脂，各5份，分别加入30 mL质量浓度为 0.05 mg/mL，pH值为2、4、6、8、10的沙枣黄酮粗提液，在 30 ℃ 下以100 r/min的转速在恒温摇床中振荡2 h，过滤，测定滤液中黄酮含量，计算吸附率。

1.3.5.3最佳上样流速的确定选用1 cm×30 cm玻璃柱，用优选后的树脂湿法装柱，按径高比1 ∶10装柱。分别取 10 mL 质量浓度0.05 mg/mL、pH值为4的沙枣黄酮粗提液，分别以0.2、0.5、1.0、2.0、3.0 mL/min流速上样，然后用蒸馏水洗脱至流出液接近无色，分别收集流出残余液、水洗液，继而用70%乙醇进行洗脱，收集流出液至无色，测定各个收集液中的黄酮含量，并计算吸附率。

1.3.5.4最佳洗脱液浓度的确定精确称取5.0 g抽干水分的优选树脂，各5份，分别加入30 mL质量浓度为 0.05 mg/mL、pH值为4的沙枣黄酮粗提液，在30 ℃下以 100 r/min 的转速在恒温摇床中振荡2 h，过滤，过滤后收集吸附残液，测定Pa，继续用蒸馏水洗脱至流出液接近无色，收集水洗液，然后分别用50 mL 30%、45%、60%、75%、95%乙醇溶液洗脱吸附饱和树脂，用摇床持续振荡5 h后，分别测定洗脱液中总黄酮浓度，计算解吸率，筛选最佳洗脱液浓度。

1.3.5.5最佳洗脱流速的确定参照“1.3.5.3”节方法制备沙枣黄酮粗提液，以0.5 mL/min流速上样，待吸附完全后，先用纯净水洗去未吸附部分至水洗流出液无色后，再用60%乙醇分别以0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mL/min的流速洗脱，收集洗脱液，测定洗脱液中总黄酮含量，计算各条件下的解吸率。

1.3.5.6泄漏曲线制备按“1.3.5.5”节上样、冲洗后，再用60%乙醇以0.5 mL/min流速洗脱、分段收集流出液，每 5 mL 收集1次，测定收集液中黄酮含量，绘制泄漏曲线。

1.3.5.7洗脱曲线制备根据泄漏曲线试验结果，取30 mL质量浓度为0.05 mg/mL、pH值为4的沙枣黄酮粗提液，以 0.5 mL/min 流速通过层析柱，吸附饱和后，先用蒸馏水洗去树脂表面的糖类及杂质，直至流出液为无色后，再用60%乙醇以0.5 mL/min流速洗脱，每5 mL收集1次，测定洗脱液黄酮含量，绘制洗脱曲线。

1.3.5.8工艺验证试验根据上述试验结果，确定沙枣总黄酮最佳纯化工艺条件，按此条件平行做3次试验，分别计算得率和纯度，相关公式：

黄酮得率=洗脱液中总黄酮质量/上样液中总黄酮质量×100%；

黄酮纯度=洗脱液中总黄酮质量/洗脱液中总固形物质量×100%。

2结果与分析

2.1树脂的筛选结果

由表1可知，XAD7HP、X-5型大孔树脂的吸附能力较强，其中XAD7HP型树脂吸附量最大，而且解吸率比X-5高18.06%。经比较，确定选用XAD7HP型大孔樹脂。

2.2大孔树脂分离纯化沙枣总黄酮的工艺优化结果

2.2.1最佳上样浓度的确定由图1可以看出，随着样品质量浓度的增加，树脂吸附率先上升然后下降并趋于平缓，当样品质量浓度为0.05 mg/mL时，树脂吸附率达到最大值 84.86%。黄酮溶液浓度是影响树脂吸附性能的重要因素之一，样品质量浓度增加，则其黏度增大，黄酮向树脂内部传质速度慢，使得有些黄酮没有及时被吸附就流出来；此外，样品浓度增加，竞争性吸附的杂质也在增加，这些杂质的存在减少了有效吸附面积，导致树脂吸附率下降。从图1还可看出，提高样品质量浓度有利于提高树脂的吸附效果，但是样品质量浓度过高的话，反而会降低树脂吸附率，因此用XAD7HP树脂吸附沙枣黄酮时，样品质量浓度以0.05 mg/mL左右为宜。

2.2.2最佳上样pH值的确定从图2可以看出，样品液pH值为4时，XAD7HP树脂的吸附率最高；当pH值>4时，随着pH值升高，XAD7HP树脂的吸附率下降。原因可能是pH值是影响大孔树脂吸附能力的因素之一，一般来说，酸性化合物在酸性介质中的吸附较充分。黄酮类化合物具有酚羟基，显弱酸性，在酸性条件下吸附较好，但是本试验中样品液pH值为2时吸附率不升反降，可能是酸性太强，样品液中的黄酮类化合物转变为佯盐而溶解，因而不易被吸附[13]。所以，本试验选择pH值为4的沙枣黄酮粗提液上样。

2.2.3最佳上样流速的确定表2结果表明，随着上样流速的增大，XAD7HP型大孔树脂的吸附率下降。原因可能是减慢流速能使待分离物质和树脂充分接触，有利于吸附；但是，流速太慢容易造成死吸附且费时，故根据试验结果，选择上样流速为0.5 mL/min。

2.2.4最佳洗脱液浓度的确定由表3可知，随着乙醇体积分数的不断加大，沙枣总黄酮的解吸率先表现为不断上升；但当体积分数≥75%时，解吸率反而有所下降。可能原因是由于乙醇体积分数的升高会增加醇溶性杂质含量，使得沙枣总黄酮在洗脱液中的溶解度减小，从而造成了解吸率的先升后降。因此，本试验选择60%乙醇作为洗脱剂较为适宜。endprint

2.2.5最佳洗脱流速的确定从图3可以看出，随洗脱流速的加快，沙枣总黄酮的解吸率整体呈下降趋势。对于一定量的洗脱剂而言，加快洗脱流速，会使洗脱剂中的溶质分子与大孔树脂的作用时间缩短，溶质分子来不及扩散到树脂的内表面将黄酮彻底洗脱下来，从而使解吸率下降；但流速过慢时，又会导致操作时间过长，降低生产效率。因此本研究选择洗脱流速为0.5 mL/min。

2.2.6泄漏曲线图4结果表明，沙枣总黄酮在第6份流出液处未吸附率（即洗脱液黄酮浓度）明显增大，之后变化趋于平缓，说明树脂柱在第6份流出液处出现泄漏拐点。为最大程度地吸附沙枣总黄酮，同时又节约料液、提高生产效率，设定第6份处为泄漏点，据此确定30 mL作为最大上样量。

[TPLR44.tif]

2.2.7洗脱曲线由图5可以看出，XAD7HP型树脂的洗脱峰窄而尖锐，被解吸的黄酮主要集中在10～30 mL体积范围内。从第8份流出液开始，总黄酮浓度几乎没有变化，说明树脂柱基本被洗脱干净。为了节约洗脱剂，缩短生产周期，确定40 mL作为最大洗脱体积。

[TPLR55.tif；S+2mm]

2.2.8工艺验证结果在最佳工艺条件下，沙枣料液中总黄酮的得率分别为76.42%、78.17%、79.54%，平均得率为 78.04%；总黄酮的纯度由原来的15.24%提高到48.77%。

3结论与讨论

在1 cm×30 cm玻璃柱中，按径高比1 ∶10湿法装柱，考察了7种不同型号大孔树脂对沙枣总黄酮的静态吸附及解吸性能，由于XAD7HP型大孔树脂对沙枣总黄酮有较高吸附量和解吸率，故选用XAD7HP型树脂进一步优化沙枣总黄酮的分离纯化参数。综合各项试验结果可以确定：采用30 mL质量浓度为0.05 mg/mL、pH值为4的沙枣黄酮粗提液以 0.5 mL/min 流速上样，完全吸附后用蒸馏水洗脱至流出液接近无色，继而用40 mL、60%乙醇以0.5 mL/min速度进行洗脱，可达到XAD7HP型树脂对沙枣总黄酮分离纯化的最佳效果，总黄酮的纯度由原来的15.24%提高到了48.77%，试验结果比较理想。笔者所在课题组将在此试验结果的基础上，继续深入研究沙枣中的黄酮类化合物成分，采用先进分离纯化手段，以期得到高纯度的沙枣黄酮单体，并研究其体外抗氧化活性，为更好地开发利用沙枣这种中药提供更多科学依据。

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