从中西医结合角度建立类风湿关节炎的细胞和动物模型※

薛崇祥 韩 蕊 何世勇 肖 楠 张 琳

（大连医科大学中西医结合研究院/中西医结合学院，辽宁 大连 116044）

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA） 是指一种以慢性、对称性多关节炎为主要特征的、原因不明、全身性炎性改变的自身免疫性疾病[1]。滑膜炎的持久反复发作，导致关节软骨及骨质破坏，最终导致关节畸形及功能障碍；在中医上属于“痹症”范畴。随着类风湿关节炎研究的深入，出现了很多不同的类风湿关节炎的研究模型。本文通过查阅文献资料，就类风湿关节炎的细胞和动物建模方法、造模机制、评价指标及方法优劣等方面的研究作一简要综述。

1 类风湿关节炎细胞模型与检测指标

类风湿关节炎细胞模型的建立是进行类风湿关节炎细胞体外研究的基础，是类风湿关节炎实验研究的重要组成部分[2]。

高皖皎等[3]用胶原酶法分离获取AA-FLS细胞进行原代培养，观察各代细胞形态特征，免疫细胞化学方法鉴定细胞；CCK-8法检测AA-FLS与正常大鼠FLS的增殖活性差异；ELISA测定细胞TNF-α和比IL-1β的分泌水平；Hochest33258法考察细胞调亡状态；Western Blot检测AA-FLS细胞线粒体调亡通路重要调控蛋白Bcl-2和Bax及Pro-Caspase-3和Cleave-Caspase-3的表达水平。

杨亚旭等[4]选择类风湿关节炎滑膜成纤维细胞培养至3～7代，流式细胞术检测细胞表面标记抗体，验证为RA-FLS细胞。待细胞增殖至适当数目后接种于六孔板中，除空白对照外其余各孔加入10ng/mL TNF-α诱导RA-FLS细胞成为异常增殖的类风湿关节炎细胞模型。MTT法检测细胞增殖情况；Western Blot检测不同处理组Wnt-1、P-catenin、C-myc及DKK-1蛋白的表达情况。

宁乔怡等[5]通过细胞培养，在体外构建类风湿关节炎滑膜成纤维细胞模型。将类风湿关节炎患者的滑膜组织原代培养，经传代去除杂质后，获取纯净的FLS，采用波形蛋白检测，鉴定FLS。取3～5代对数生长期细胞用于后期实验。

彭孝武等[6]建立AIA大鼠滑膜成纤维细胞和单核细胞共培养诱生破骨样细胞模型。先建立AIA大鼠模型，取其双侧膝关节滑膜组织，单核细胞作为诱导形成OLC的前体细胞，将传代至3～5代的SFs制备成细胞悬液，培养，诱导生成具有典型破骨细胞特征的OLC，经抗酒石酸酸性磷酸酶 (TRAP)染色阳性的多核 (≥3核)细胞为OLC。

马莎等[7]比较胶原酶消化法、改良组织块法、双酶消化法三种方法对RASFs细胞进行培养，采用倒置相差显微镜观察细胞形态及生长特性，以Vimentin组织化学法进行鉴定，台盼兰计数培养14天后所得活细胞数目。结果发现改良组织块培养法能最大限度地利用滑膜组织，获得最多数量原代RASFs细胞，是建立体外类风湿关节炎细胞模型最高效、快捷的方法。

2 类风湿关节炎动物模型

2.1 西医

2.1.1 Ⅱ型胶原蛋白诱导大鼠类风湿关节炎造模方法 首先用75%的乙醇擦拭大鼠尾根部皮肤，然后将该乳剂于大鼠尾根部皮内从基底部2 cm于尾根部皮下注射0.1 mL致炎。21天后按0.1 mL/只，再于尾根部皮下加强免疫1次。

为了保证免疫条件的齐同性，各组均在同一时间免疫，即以免疫时间为基准点。然后开始CIA诱导致炎。一般大鼠免疫10天起相继出现踝关节肿胀，行动迟缓、跛行。正常对照组食欲、活动、大便正常，背毛光泽，反应灵活[8-11]。

2.1.2 佐剂性关节炎动物模型 按佐剂的不同分为完全佐剂（CFA）和不完全佐剂（IFA），其中CFA使用最多。

完全佐剂是将无水羊毛脂与液体石蜡按1∶2的比例配成1 mL混合液，高压灭菌后加入10 mg在80℃灭活1 h的减毒卡介苗或干燥结核菌制成。造模大多选取雄性大鼠等动物，注射方法采用后足跖部或尾根部皮内注射，一次性皮内注射CFA 0.1 mL，制备成AA模型[12-13]。

朱玉芳等[14]于大鼠右足趾皮下注射福氏完全佐剂（CFA），造模后第7、14、21、28天对2组大鼠进行关节炎评分，发现模型组关节肿胀明显，大鼠表现接近于人体的类风湿关节炎，且造模过程简单、稳定，是研究RA的较理想模型。

2.2 中医证型 根据2016年最新的《中医病症诊断疗效标准》[15]，将类风湿关节炎分为6种不同证型，分别是风寒湿阻、风湿热郁、痰瘀互结、肾虚寒凝、肝肾阴虚、气血亏虚。考虑到“同病异治”和“异病同治”的中医差异性，分别以6种证型名称以及“动物模型”作为关键词，搜索中国知网、万方、维普数据库近10年的文献数据，时间期限为“2007年1月1日—2017年1月1日”，搜索国内外相关文献，以期用不同方法建立不同证型的类风湿关节炎中医动物模型，达到类风湿关节炎病证结合造模方法对比、优化和规范的目的。

2.2.1 风寒湿阻 王拥军等[16]模拟自然界不同风寒湿的刺激，选用新西兰白兔作为实验对象，利用SHH-250GS人工气候造模箱，调整风力、温度、湿度，以建立中医风寒湿痹证型颈椎病动物模型。这种方法利用模拟的自然条件对实验动物进行处理，因为类风湿关节炎是一种长期的慢性疾病，故处理时间较长，耗时耗力；同时，风寒湿邪长期处理会对全身其他器官和系统造成差异性的影响，影响造模动物最终实验结果。

林孟没有在家，他早晨七点半的时候就出门了，他去工厂上班了。沈天祥，王飞，陈力庆这时候也应该在他们各自的地方上班干活。只有我和萍萍……我对萍萍说：“只有我们两个人？”

陈勇等[17]选用Wistar雄性大鼠作为造模材料，从大鼠尾根部、颈背部皮内多点注射小牛Ⅱ型胶原（完全弗氏佐剂乳化），7 d后再于尾根部和背部皮内注射胶原加强免疫，期间在造模箱里给予风寒湿3种外界刺激，建立病证结合的类风湿关节炎风寒湿痹动物模型。这种方法与前者相比，结合了化学性刺激，缩短了处理时间，是前者的一种进步与改良。

2.2.2 风湿热郁 王静等[18]通过湿热环境、高脂饮食、微生物感染三因素结合造模方法复制湿热证相关模型，根据湿热痹即痹证+湿热证的特点，进行湿热痹动物模型的建立。先制作佐剂性关节炎模型，次日开始每日将大鼠置于相对湿度为95%的环境中，并连续3日将大鼠放于熏蒸器（自制）上，每日8小时，观察大鼠后足左右足跖肿胀情况，大鼠后足关节开始出现二次反应，左足出现关节红肿为造模成功。

2.2.3 痰瘀互结 在建立痰瘀互结动物模型的实验中，多采用高脂饲料喂养，并以脂肪乳液灌胃的方式使研究动物达到高脂血症的典型状态[19-23]，以“肥人多痰湿”的理论为依据，气血不能正常运行，以致血瘀痰凝壅结，最终达到建模目的。在类风湿痰瘀互结证的研究中缺乏此类报道，具体有效的建模方法有待进一步探究。

2.2.4 肾虚寒凝 王燕等[24]在观察不同品系、不同品种大鼠时，考虑到价格、可行性、发病率和发病程度，发现制作痹症（类风湿关节炎）大鼠模型时，首选SD大鼠，其次Wistar大鼠，雌雄均可。按常规方法切除大鼠双侧睾丸或卵巢，去势后4周，尾根部皮下注射Ⅱ型胶原，7天后注射量减半，加强免疫一次，验证造模成功。

2.2.5 肝肾阴虚 刘文兰等[25]采用长期激怒法制备肝肾阴虚证动物模型，在此基础上使用CCl4原液一次性腹腔内注射，复制CCl4急性肝损伤模型，并从一般状态、饮水量、进食量、游泳时间、肛温、唾液酸碱度、体重减轻、肝脏系数、肝功能、肝脏形态、肝组织病理等方面对模型进行评价。但目前也尚未发现有关类风湿肝肾阴虚证型的有关研究。

2.2.6 气血亏虚 苗明三等[26]在前期研究的基础上，综合放血与环磷酞胺造血虚模型的特点，相互克服所造模型的不足，并对放血量和放血次数，环磷酞胺应用剂量和方法进行了探讨，摸索造模最佳方法。尚未发现相关报道中有类风湿关节炎专门的气血亏虚动物模型建立方法，是否可以借鉴类风湿关节炎其他中医证型进行病证结合动物模型建立，还有待进一步观察和实验。

3 评价标准

多评价标准联合是如今动物模型评价的主流方向，但关于类风湿关节炎动物造模是否成功的评价标准种类较多且较为混乱，从整体、组织器官、细胞和分子角度进行评价的标准大致有以下几种。

张栋等[28]在中医症候模型复制方法的研究中，主张“证”的动物模型，应该符合临床“证”的要求为标准，从模型动物的表现、中医理论模拟的造模因素、“证”的客观指标以及方药反证四个方面进行整体水平评价。

3.2 组织器官水平评价指标 在关节表现上，可发现造模动物足关节出现对称性红肿胀痛、关节僵硬，活动受限，随着炎症的进展，关节不能负重，皮肤溃疡或关节变形。相比于MRI和PET-CT，X线检查相比较为常用，能观察到骨关节改变；关节肿胀度评分可以用来测定关节改变程度。定期制作模型动物病变关节的病理切片观察，观察滑膜、血管翳的形成等多种指标，可观察到滑膜脂肪水肿及肉芽组织形成，软骨组织及骨组织呈典型的关节炎病变[29-30]。

3.3 细胞水平评价指标 滑膜细胞明显增生，层次增多，排列紊乱，并可见红细胞沉降率明显升高，中性粒细胞、单核细胞、淋巴细胞浸润，破骨细胞异常增生[4，31]。

3.4 分子水平评价指标 从免疫学分子改变的角度分析，出现高滴度的IgG抗体，测量类风湿因子（RF）、白细胞介素IL-6、IL-1、抗Ⅱ型胶原的量[32]。

4 讨论

随着类风湿关节炎的研究不断深入，类风湿关节炎的细胞和动物造模方法显得尤为重要，相关实验方法慢慢趋于完善，但由于实验细胞与动物和人体的差异性，每种方法都不能完全代替个体，造模方法也在不断地完善。

从上述类风湿关节炎的细胞模型来看，对细胞模型的实验与研究较少，细胞类型以类风湿关节炎滑膜成纤维细胞和破骨样细胞为主。以原代分离培养的MH7A为研究对象能更加真实地反映类风湿关节炎患者体内的病理状态，可作为类风湿关节炎理想的体外细胞模型，但原代细胞来源有限，且增殖速度相对缓慢，使用代次有限[7]，其他滑膜成纤维细胞体外培养方法对培养出的细胞要求较高。用细胞模型进行的细胞实验在通路的探索和高通量筛选等方面有明显的优势[34]，而且相比于动物实验模型的建立具有省钱、重复性高和试验周期短等优点[33]，但体外实验的疗效却不能代表体内实验，可以作为体内实验的验证方式。

从上述类风湿关节炎的动物模型来看，Ⅱ型胶原蛋白诱导大鼠类风湿关节炎（CIA)和佐剂性关节炎动物模型（AA）造模方法是最常用的两种方法。AA动物模型操作简单、费用低，是应用较经典的类风湿关节炎造模方法，但滑膜增生和软骨破坏则不明显，缺少慢性病理过程，且在免疫学特点及病理学特征和人类类风湿关节炎有着一定的种属差异。CIA不仅有类似类风湿关节炎的急性病变特点，还存在一定的慢性病理特征，且操作简单，多数学者认为CIA更接近理想类风湿关节炎。CIA同样存在缺陷，不能描述病情的加重与缓解，造模方法无相对统一规范[34]。不同证型的类风湿关节炎中医动物模型是病证结合动物模型的进步，既有西医疾病的诊断特征，又有中医症候的病因病机和不同表现。同时，也必然要求类风湿关节炎动物模型能够最大限度地接近人的类风湿关节炎，这就需要一方面考虑动物与人存在的种属差异，另一方面考虑四诊信息不易搜集，使动物模型本身的成功性和代表性存在一定的偏差[35-44]，选择合适的动物模型建立方法。

不管是细胞模型还是动物模型，都是类风湿关节炎研究中不可缺少的实验材料。随着新型治疗类风湿关节炎药物的临床需求日益严峻，创新抗类风湿药的研制仍未有革命性的突破，不断完善实验细胞模型和动物模型的建立方法将会对探索类风湿关节炎病理生理机制和治疗提供帮助，为后续中西医治疗类风湿关节炎提供基础资料。

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