口蹄疫病毒细胞培养技术研究进展

李顺琴，杨君敬，何 诚*，王贺民

(1.中国农业大学动物医学院，北京 100193；2.中牧研究院疫苗工艺研究所，北京 100194)

口蹄疫(Foot-and-mouth disease,FMD)是由口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)引起的一种急性、热性、高度接触性动物疫病，该病传播迅速，能形成大范围的流行，严重影响畜牧业的健康发展，危害人类健康，并且造成巨大的经济损失[1]。控制口蹄疫的发生与流行非常重要，其最有效的方法之一便是生产出高效能、稳定性强、安全性好的疫苗。口蹄疫病毒有A型、O型、C型、南非Ⅰ型(SATⅠ型)、南非Ⅱ型(SATⅡ型)、南非Ⅲ型(SATⅢ型)和亚洲1型(Asia1型)等7个血清型和多种亚型，各血清型之间不能交叉保护，同一主要血清型内各亚型间交叉保护力也较弱。FMDV灭活疫苗最早于20世纪20年代出现在欧洲，由动物组织经氢氧化铝吸附、甲醛灭活制成，但成本高、易散毒和免疫保护力低，因而未能推广应用。20世纪40年代,Schmidt和Waldman等将FMDV接种于健康牛舌内，发病后取牛舌水疱皮和水疱液，经甲醛灭活后制成铝胶苗，获得了较高的免疫保护力。1947年Frenkel首次用牛舌皮碎块培养病毒获得成功，生产了甲醛灭活疫苗。1962年Mowat和Chapman等开始用乳仓鼠肾细胞(BHK-21)培养口蹄疫病毒并制备灭活疫苗。1966年Lapstich和Telling等开始用BHK-21细胞深层悬浮培养法制备口蹄疫疫苗。20世纪80年代随着大型发酵罐培养细胞和增殖病毒技术的成熟，病毒性疫苗生产进入了一个新的时代。我国于20世纪60年代起用OPK弱毒、OKIV毒株和OY/80毒株等经灭活制成油佐剂疫苗。随后O型口蹄疫灭活疫苗均是细胞培养灭活疫苗，常用的有OR株、onxc株、HK株、JMS株、OS株和制备浓缩苗的OZK毒株等[2-4]。

FMDV能在多种动物细胞内增殖，包括原代细胞，如牛舌上皮细胞、牛甲状腺细胞、牛胎皮肤-肌肉细胞、仔猪心肌细胞、猪肾细胞、仓鼠肾细胞、牛肾细胞和豚鼠肾细胞等，还有传代细胞系，如犊牛甲状腺细胞系、猪肾上皮细胞(PK-15)、仔猪肾上皮细胞 (IBRS-2)和仓鼠肾细胞(BHK-21)等，FMDV对原代细胞的敏感性虽然较传代细胞好，但是其在原代细胞上达到的病毒含量低于传代细胞系(原代细胞每0.1 g组织含1TCID50～5TCID50，传代细胞中可达106TCID50～107.5TCID50)。此外，不同型毒株在同一细胞及同一毒株在不同细胞上的生长状态有一定的差异[3]。犊牛甲状腺细胞对FMDV最敏感，适于感染组织分离增殖病毒。FMDV在牛舌上皮细胞内易于生长，24 h收获病毒时，毒价可达106TCID50/mL～108TCID50/mL。IBRS-2细胞系和BHK-21细胞系常用于进行口蹄疫病毒的分离培养。口蹄疫病毒的培养技术主要为贴壁培养技术和悬浮培养技术，后者是FMDV大规模培养的主流模式[2,5-6]。

1 贴壁细胞培养

1.1 贴壁细胞的选择

1935年Frenkl用牛、羊、猪的胚胎皮肤细胞来培养FMDV首次获得成功，1947年在牛舌上皮细胞上增殖FMDV。1955年Sellers成功用猪肾细胞增殖FMDV。Mowat，Chaprnan和Capstick发现FMDV可以在仓鼠肾(BHK)细胞系上增殖[5]。FMDV不同的血清型对细胞适应性不同，且该病毒各毒株间在细胞上的增殖能力也存在很大差异。如口蹄疫病毒O型和A型病毒的含量超过108.0TCID50/0.1 mL，C型感染滴度可达107.5TCID50/0.1 mL，Asia1型病毒可达106.0TCID50/0.1 mL～107.0TCID50/0.1 mL。O型病毒在猪肾细胞系上需8 h～9 h，其病毒滴度便达到最高，而该型某一分离株在BHK-21细胞上只需3.5 h，就能使全部细胞出现细胞病变(cytopathic effect,CPE)，另一克隆株产生CPE需6 h～12 h。

1.2 贴壁细胞的营养需求和培养条件

Dulbecco和Sanford等发明了用胰蛋白酶消化分离组织细胞的方法，建立单层细胞培养技术[7]。FMDV的单层细胞培养方法已广泛用于口蹄疫的诊断和FMDV培养特性等研究中，优缺点简要概括如表1所示。

1.3 微载体细胞培养

1967年Van Wezel提出了“微载体”培养系统的新技术概念[8-9]，种类有液体微载体、大孔明胶微载体、聚苯乙烯微载体、PHEMA微载体、甲壳质微载体、聚氨酯泡沫微载体、藻酸盐凝胶微载体以及磁性微载体等。商品化微载体主要是固体微载体[8]，纸片载体也开始活跃在细胞大规模培养领域。微载体细胞培养法能实现细胞大规模培养，易于检测和控制培养系统环境因素和细胞的生长情况，培养基利用率高，培养工艺放大较易，设备可系统化和自动化。表2对目前市场常用的几种微载体的特点进行了对比。

细胞培养基选择：天然培养基因其成分复杂，会影响某些产物表达和实验结果的分析。自Eagle成功开发人工合成培养基，大大促进了细胞培养技术发展。其主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐、谷氨酰胺和其他一些辅助物质，使用前需补加一定量的血清。原代细胞培养液和传代细胞培养液组成成分基本相同，根据细胞生长状态调整细胞培养液中血清含量。原代细胞培养液用量少，营养消耗慢，故应保证培养液的新鲜。对贴壁细胞进行大规模培养，反应器与细胞直接接触的培养表面要求生物相容性和亲水性较好，且反应器具备耐高温、耐高压和在线灭菌等要求。同时，反应器剪切效应低、混合效率高、细胞生长环境稳定、细胞贴壁性良好、细胞生长状态容易被监测和控制，反应器培养工艺容易放大，产品质量稳定。

表1 贴壁细胞培养优点和缺点

表2 几种常用微载体的优点、缺点

2 悬浮细胞培养

2.1 细胞系选择

1951年Evans报道了细胞深层悬浮培养技术，1962年Copstick和Guillotean报道了BHK-21深层悬浮细胞培养法，包括自动调节pH、温度及转数和密闭循环式的培养等[10]。目前，用于悬浮培养的细胞系主要是BHK-21和IBRS-2细胞系。由于细胞对FMDV敏感性、感染滴度和培养难易有差异，国际上常用BHK-21细胞系悬浮培养FMDV。 FMDV不同血清型培养24 h时感染滴度有所不同，同一毒株在不同细胞培养系统中生长特性也不尽相同，详细见表3。

表3 FMDV不同型毒株的培养特性

2.2 悬浮培养营养条件和设备选择

口蹄疫病毒细胞培养需加入血清，血清易发生外源微生物的污染，批次间容易产生较大差异。因此，驯化筛选动物细胞适应低血清,甚至使用无血清培养基，成为悬浮细胞培养FMDV的研究热点。表4列出了有血清培养基和无血清培养基2种方法悬浮培养细胞的优点与不足。

由于口蹄疫病毒生长特性，全悬浮细胞培养法更适于培养口蹄疫病毒。悬浮细胞培养法较贴壁培养法体现出诸多优势，见表5所示。

表4 悬浮细胞培养方法优缺点

表5 贴壁培养和悬浮培养方法比较

悬浮培养用设备主要有搅拌式生物反应器、气升式生物反应器、膜式生物反应器、旋转式细胞反应器、波式生物反应器和中空纤维生物反应器等[11-13]。搅拌式生物反应器机械搅动时产生的剪切力会损伤培养的细胞，添加血清蛋白成分可以减少损伤，因此较适合进行有血清悬浮培养口蹄疫病毒；气升式生物反应器较搅拌式生物反应器剪切力降低，对细胞损伤减少，但在高密度规模化培养细胞过程中，通气过程会对细胞造成损伤；膜式生物反应器降低了剪切力对细胞的损伤，避免了气泡和流体剪切力的产生，故其较适合容易受到剪切力破坏的动物细胞的培养；中空纤维生物反应器能够持续供应营养物质，因此不受营养物质限制和有毒代谢产物积累的影响，且能在无血清培养基中培养细胞[14]。

3 小结与展望

虽然无血清悬浮细胞培养技术是大规模生产口蹄疫病毒理想目标，但是还存在诸多技术难题，如优化细胞培养环境[15]、改变细胞特性、病毒修饰改造。此外，基因编辑技术[16]、细胞生物编程和细胞微环境改造，可为FMDV培养提供新的技术途径。

3.1 基因编辑技术对FMDV的修饰

RNAi技术属于基因下调(knockdown)方法，不具备完全去除基因的功能，属于第1代基因编辑技术。锌指酶ZFN(zinc finger nucleases)和TALEN(transcription activator-like effector nucleases)技术属于基因编辑的第2代技术，第3代基因编辑技术CRISPR/Cas已经成为了基因组编辑的强大工具[17-19]。利用该基因编辑技术对FMDV基因进行改造和修饰，获得生产性能高、抗原匹配性好、免疫应答能力强和生物安全性好等特征的疫苗种子毒。此外，敲除或沉默FMDV某个基因片段，开发更安全的疫苗毒株，生产出满足防疫要求的疫苗[20]。目前，基因编辑技术可以实现人工控制病毒复制，使疫苗研发不再复杂，在许多生物工程领域取得了突破性发展。

3.2 细胞生物编程和细胞微环境改造技术

诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cell,iPSC)是2006年由日本京都大学山中伸弥(Yamanaka S)研究团队首次获得[21]。2007年，该日本研究小组和两个美国研究小组将细胞再编程技术应用到了人体细胞上，获得人类iPSC[22-23]。iPSC技术自其诞生以来，主要集中在体细胞和重编程因子的选择、重编程因子介导载体体系的建立、诱导转化率的提升以及疾病特异性的iPSC模型的建立等方面。通过导入一些基因改变细胞生长周期的调控，可使细胞在无血清的培养基中生长，从而降低细胞培养污染风险和成本。

3.3 生产设施自动化控制工艺

随着生物工程和组织工程学的发展，相应的生物反应器水平也在不断提高。现阶段生物反应器设计平台建立了计算机实时监测与控制技术[24]，通过检测培养过程中细胞耗氧速率的变化，对培养过程中生理生化关键参数进行监测和控制，如细胞浓度、温度、pH和溶解氧浓度等参数，以及代谢产物检测、OUR等[25]，为动物细胞工业化培养过程的自动化实时监测和控制奠定了基础。

生产口蹄疫疫苗关键因素在于获得高浓度、成本低的病毒抗原。无血清悬浮细胞培养技术可以实现产业化和降低生产成本。基因编辑技术通过病毒修饰、细胞适应性的修改，获得免疫原性高、增殖性能优良的种子毒，能适应不同血清型病毒增殖的通用型细胞株。此外，针对细胞生长的微环境，研究成本更低的培养基和配套的自动化设施，以此可以降低口蹄疫病毒生产成本。

[1] 刘湘涛.口蹄疫[M].北京:中国农业出版社,2015:271-273.

[2] 滕家蕊.口蹄疫新型疫苗研究进展[J].福建畜牧兽医，2016,38(6)：34-36.

[3] 李世芳，邵军军，常惠芸.口蹄疫表位疫苗的研究进展[J].中国畜牧兽医，2017，44(2)：396-401.

[4] 高佃平.口蹄疫合成肽疫苗研究新进展[J].畜牧兽医，2015(3):25-26.

[5] 刘 磊.家畜口蹄疫防制[M].北京:金盾出版社,2010：25-30.

[6] 刘建福，胡位荣.细胞工程[M].湖北武汉：华中科技大学出版社,2014.

[7] 谯小燕，宋志刚，哈斯毕力格，等.纸片微载体培养BHK-21(C-13)细胞制备兽用狂犬冻干活疫苗[J].中国兽药杂志，2013，47(5):42-45.

[8] 李 群.动物细胞悬浮培养技术在兽用疫苗生产领域中的应用[J].中国畜牧兽医,2013,40(6):236-239.

[9] 佛生福，马 祺，王 丹，等.我国BHK-21细胞悬浮培养生产口蹄疫疫苗的进展[J].西北民族大学学报:自然科学版，2016，37(2):70-71.

[10] Agabalyan N A,Borys B S,Sparks H D,et al.Enhanced expansion and sustained inductive function of skin-derived precursor cells in computer-controlled stirred suspension bioreactors[J].Stem Cell Transl Med,2016,5(9):1033-1038.

[11] 严 石.悬浮培养技术在兽用疫苗领域中的应用[J].中国兽医杂志，2016,53(3):76-78.

[12] Mizukami A,Fernandes-Platzgummer A,Carmelo J G,et al.Stirred tank bioreactor culture combined with serum-/xenogeneic-free culture medium enables an efficient expansion of umbilical cord-derived mesenchymal stem/stromal cells[J].J Biotechnol,2016,11(8):1048-1059.

[13] Berry J D,Liovic P,Sutalo I D,et al.Characterisation of stresses on microcarriers in a stirred bioreactor[J].Appl Mathemat Model,2016,40(15-16):6787-6804.

[14] de Soure A M,Fernandes-Platzgummer A,Da S C,et al.Scalable microcarrier-based manufacturing of mesenchymal stem/stromal cells[J].J Biotechnol,2016,236:88-109.

[15] Wang T,Green R,Nair R R,et al.Surface acoustic waves (SAW)-based biosensing for quantification of cell growth in 2D and 3D cultures[J].Sensors,2015,15(12):32045-32055.

[16] Liu H,Zeng F,Zhang M,et al.Emerging landscape of cell penetrating peptide inreprogramming and gene editing[J].J Contro Release,2016,226(2):124-137.

[17] Gagnon J A,Valen E,Thyme S B,et al.Efficient mutagenesis by Cas9 protein-mediated oligonucleotide insertion and large-scale assessment of single-guide RNAs[J].PLoS One,2014,9(5):e98186.

[18] Savitskaya E E,Musharova O S,Severinov K V.Diversity of CRISPR-Cas-mediated mechanisms of adaptive immunity in prokaryotes and their application in biotechnology[J].Biochemistry,2016,81(7):653-661.

[19] Sessions J W,Skousen C S,Price K D,et al.CRISPR-Cas9 directed knock-out of a constitutively expressed gene using lance array nanoinjection[J].Springerplus,2016,5(1):1521-1532.

[20] Lin C Y,Su Y H.Genome editing in sea urchin embryos by using a CRISPR/Cas9 system[J].Dev Biol,2016,409(2):420-428.

[21] Chamberlain S J.Disease modelling using human iPSCs[J].Human Molecul Genet,2016,25(2):173-181.

[22] Chari S,Mao t,Timeline:iPSCs-the first decade[J].Cell Stem Cell,2016,18(2):294.

[23] Lieberman R,Kranzler H R,Levine E S,et al.Examining FKBP5 mRNA expression in human iPSC-derived neural cells[J].Psychiat Res,2017,247:172-181.

[24] Nunes P S.Real-time direct cell concentration and viability determination using a fully automated microfluidic platform for standalone process monitoring[J].Analyst,2015,140(12):4007-4020.

[25] 王誉树.生物反应器智能测控系统的研制[D].浙江杭州：杭州电子科技大学,2014.