外泌体的产生及其生物学作用的研究进展

王 璐，孟 琳，刘树威，张 恺，孟许亚，王梓霖，孙宏晨,

(1.吉林省牙发育及颌骨重塑与再生重点实验室，吉林 长春 130021；2.吉林大学口腔医院口腔病理科，吉林 长春 130021；3.吉林大学化学学院超分子结构与材料国家重点实验室，吉林 长春 130012)

外泌体为直径40～100 nm的细胞外囊泡，具有双层脂质结构。1983年在研究网织红细胞成熟为红细胞过程中产生转铁蛋白时发现了外泌体[1]。当时外泌体被认为是细胞处理废物的一种手段而被研究者所忽略。研究[2]表明：外泌体作为信号分子的载体，可以介导细胞间通信和细胞间大分子的传递，促进蛋白质、脂质、mRNA、miRNA和DNA的转运及疾病的发展，将参与生理和病理过程的信号分子传递到受体细胞。外泌体不是细胞合成的单纯聚合物，而是由细胞膜出芽而来，其能更好地被宿主耐受，同时也可以作为药物的有效载体。由于外泌体广泛存在于体液中，不仅容易获取且携带了其来源细胞内的特异性物质，使得其在科研及临床方面具有潜在用途[3]。近年来，随着科学技术的发展，外泌体受到越来越多的关注。然而，关于外泌体生物学的根本问题仍然未得到有效解决，进一步深入研究外泌体独特的生物学结构和功能，探讨这些结构的生物学意义，是外泌体研究中迫切需要解决的问题。本文对外泌体的产生机制、分离与鉴定、其对机体免疫过程和疾病的发生发展的作用等方面进行了全面的综述，有助于理解外泌体的生物学意义、结构和功能。

1 外泌体的简介

1.1 外泌体的分泌 虽然研究者对细胞释放外泌体的具体过程知之甚少，但大多数含有内膜系统的哺乳动物细胞均可分泌外泌体。外泌体有多种分泌途径：一种是组成型分泌途径，例如免疫系统的B细胞、树突状细胞(DCs)和肥大细胞，对外泌体的研究大部分来自于免疫细胞，而目前在非免疫细胞中生理性外泌体的分泌很大程度上是未知的；另一种途径是通过细胞间相互作用刺激分泌外泌体，例如鼠DCs在与抗原特异性CD4+T淋巴细胞相互作用时可分泌更高水平的外泌体[4]；其他类型的细胞还可以通过钙离子载体或其他刺激分泌外泌体[5]。

1.2 外泌体的产生机制 大多数常规的膜出芽过程是使膜从细胞器变形到细胞质中，而外泌体是由于细胞膜内吞形成内体，内体限制膜发生多处凹陷，向内出芽形成微囊泡(intraluminal vesicles，ILVs)，从而转变为具有动态亚细胞结构的多囊泡体 (multi-vesicle bodys，MVBs)，即晚期内体。 MVBs可以在内体限制膜处通过至少2种机制产生：一种是内吞体分选转运复合体机制(endosomal sorting complex required for transport，ESCRT)，另一种是非依赖性的ESCRT机制。ESCRT机制由一组胞质蛋白复合物发挥作用，其能识别泛素化修饰的膜蛋白。泛素标记物被第1个ESCRT复合物ESCRT-0识别，ESCRT-0富集到内体膜并将泛素化的物质传递给ESCRTⅠ和ESCRTⅡ，ESCRTⅠ中的Tsg101识别二硫键诱导内体膜凹陷，再通过ESCRTⅢ剪切芽颈，形成MVBs[6]。但在无ESCRT的情况下，MVBs仍然可以形成，如附属蛋白质ALG-2相互作用蛋白X(Alix)能够与胞内衔接蛋白syntenin直接结合参与形成外泌体。这些ESCRT非依赖性MVBs的产生可以通过MVBs上丰富的四跨膜蛋白CD63-α，也可以通过神经酰胺诱导细胞膜出芽促进MVBs的形成[7]。

MVBs可以与溶酶体融合，其内容物被降解和再循环；MVBs还可以与质膜融合，分泌到细胞外(即所谓的外泌体)。MVBs上的胆固醇水平在调节其分选中发挥重要作用，富含胆固醇的MVBs被靶向分选至细胞膜作为外泌体释放，而低胆固醇的MVBs被靶向运送到溶酶体[8]。研究者[9]在研究阿尔茨海默病的发生发展时发现：四次跨膜蛋白6(TSPAN6)可以抑制淀粉样前体蛋白C端片段(APP-CTF)进入溶酶体，促进含有APP-CTF的外泌体的分泌，从而刺激产生神经变性相关肽Aβ。

1.3 外泌体的细胞间传递 外泌体在细胞间通讯中发挥重要作用，可以影响细胞的多种功能，包括细胞因子的产生、细胞增殖、细胞凋亡和代谢等[10]。目前认为，外泌体主要通过以下方式与受体细胞结合：①外泌体将膜蛋白或其内容物转移至受体细胞，被受体细胞膜完全吞噬，这一过程需要非常规脂质LBPA和附属蛋白质Alix；②外泌体膜与受体细胞膜直接融合；③外泌体上的跨膜蛋白直接作用于受体细胞膜表面的信号分子。例如，滤泡树突细胞分泌的外泌体携MHC-跨膜蛋白，其可激活B淋巴细胞和T淋巴细胞表面的信号分子[11]。外泌体与受体细胞以何种方式结合取决于外泌体的大小及外泌体携带的物质。

2 外泌体的分离与鉴定

外泌体的分离方法包括差速离心法、ExoQuick外泌体快速提取试剂盒法、免疫亲和沉降法、蔗糖密度梯度-超速离心法和微流体分离法等[12]。其中差速离心法是最常用的外泌体分离方法，即通过较低的离心速度从培养基中分离出颗粒较大的物质，然后外泌体、小胞外囊泡及蛋白质再以非常高的速度(100 000×g)离心产生沉淀[13]。因此，差速离心只能富集而不能纯化外泌体。富集的外泌体、小胞外囊泡及蛋白质通过生物化学、质谱或电子显微镜等相关技术进行物理、化学及生物表征，从而得到进一步鉴别。

然而离心后沉淀物中细胞外囊泡和外泌体等难以进行鉴定分析。通常，对于普通细胞器(如高尔基体和线粒体等)而言，可以利用其特异性生物标记物进行鉴定。外泌体不是静态细胞器，其经历了内体、ILVs和MVBs一系列连续成熟的过程，在此过程中不断获取并失去不同的蛋白质，因此外泌体不会有一个特异性标记物。但外泌体会表达一些四次跨膜蛋白(CD63、CD81和CD9)，其中CD63可以用做目前研究外泌体的标记物，如在研究非依赖性ESCRT的MVBs的形成时需要CD63[14]。在许多研究中Tsg101也被用作外泌体的标记物，参与ESCRT依赖性外泌体的形成。

3 外泌体的主要组分

3.1 蛋白质 超过4 600种蛋白质与外泌体有关。外泌体蛋白有以下几类：①外泌体中常见的蛋白质多与其生物发生机制有关，外泌体含有的细胞质蛋白，如膜蛋白和RAB蛋白，可以促进MVBs与细胞膜的融合及外泌体的释放；Tsg-101及附属蛋白质Alix参与ESCRT过程，促进内体膜的凹陷。②外泌体含有参与抗原呈递的蛋白质，如CD1、MHCⅠ和MHCⅡ，其在免疫调节中发挥重要作用，MHCⅠ还参与向T细胞呈递抗原的生理过程。外泌体表面还存在热休克蛋白，如HSP70和HSP90，促进了抗原肽与MHCⅠ及MHCⅡ的结合[15]。③外泌体含有信号转导蛋白，如G蛋白和蛋白激酶[16]。④外泌体含有丰富的蛋白水解酶，这表明外泌体能够促进细胞转移。⑤外泌体中还含有细胞质微管蛋白、肌动蛋白和肌动蛋白结合蛋白。但目前未发现外泌体中含有与内质网、高尔基体和细胞核相关的蛋白质[17]。肿瘤细胞所分泌的外泌体可以携带特定的蛋白质，有助于肿瘤的诊断和检测。研究[18]表明：肠道简质瘤分泌的外泌体富含丰富的诊断标志物，如KIT、CD34、ANO1、PROM1、PRKCQ和ENG。

3.2 核 酸 外泌体所具有的可以将其与其他生物囊泡区分开的一大特征就是含有大量核苷酸，在外泌体内已经发现了DNA、RNA、miRNA及非编码RNA等。在外泌体中发现的mRNA为功能性RNA，转运到靶细胞后可以被翻译为蛋白质。外泌体中的miRNA，如let-7、miR-1、miR-15、miR-16、miR-151和miR-375在血管发生、胞吐作用和肿瘤发生等过程中发挥重要作用[19]。外泌体还富含肿瘤转移有关的miRNA，如来自于乳腺癌细胞系MCF-10A和MDA-MB-231的外泌体富含miRNA-105,其可减少内皮细胞中ZO-1基因的表达，促进乳腺癌向肺和脑的转移[20]。外泌体中的miR-21和miR-29a可作为配体与Toll样受体(TLR)结合激活免疫细胞[21]。

外泌体miRNA可以稳定地存在于血液、尿液和其他体液中。通过外泌体表面的特异性蛋白可以确定其组织或细胞来源。因此，外泌体miRNA可以用作生物标志物辅助疾病的临床诊断。例如，外泌体miRNA(如let-7a、miR-1229、miR-1246、miR-150、miR-21、miR-223和miR-23a)可以作为诊断结肠直肠癌的生物标志物[22]。miR-21和miR-181a-5p可以用于区分乳头状甲状腺癌及滤泡状甲状腺癌[23]。miR-1290和miR-375可以用作诊断前列腺癌预后的生物标志物[24]。

3.3 脂 质 外泌体的脂质成分包括鞘磷脂、胆固醇、神经节苷脂GM3、饱和脂肪酸、磷脂酰丝氨酸和神经酰胺。与其来源细胞的细胞膜比较，外泌体膜表面的磷脂酰胆碱和二酰基甘油含量降低[25]。但外泌体表面富含磷脂酰丝氨酸，这有利于受体细胞内化，在外泌体的生物功能方面发挥重要作用[26]。

4 外泌体与免疫

外泌体可以通过直接呈递或交叉呈递的方式向T细胞呈递抗原肽-MHC复合物，介导其对抗原的免疫应答。直接呈递是指外泌体表面的抗原肽-MHC复合物直接被T细胞捕获，从而激活T细胞。交叉呈递是指抗原呈递细胞(APCs)识别外泌体携带的抗原后，将抗原肽-MHC复合物呈递给CD8+T细胞。另外，外泌体表面的乳脂球表皮生长因子(MFGE8)、四糖蛋白和磷脂酰丝氨酸也可以直接或间接介导外泌体与APCs的结合[27]。

外泌体可以通过介导促炎症反应促进免疫反应。被细菌感染的巨噬细胞分泌的外泌体可以调节免疫反应，其可以刺激巨噬细胞和嗜中性粒细胞分泌促炎症因子，如肿瘤坏死因子α(TNF-α)和调节激活正常T细胞表达分泌因子(RANTES)。成熟的DCs分泌的外泌体可以通过TNF通路激活免疫反应。外泌体内的TNF可以诱导上皮细胞分泌促炎细胞因子[单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)、白细胞介素8(IL-8)、TNF-α和RANTES]，从而在免疫应答中发挥关键作用[28]。外泌体还可以增强巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬作用来促进免疫反应。如携带信号调节蛋白SIRPα变体的外泌体可以与CD47结合，破坏CD47与肿瘤细胞表面的SIRPα的相互作用，增强巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬作用[29]。

肿瘤细胞分泌的外泌体也可以抑制免疫反应。肿瘤细胞通过抑制T细胞和NK细胞活性，刺激骨髓来源的免疫抑制性细胞(MDSCs)来抑制免疫反应。研究[30]表明：鼠B16黑素瘤细胞释放的外泌体对小鼠巨噬细胞干扰素γ(IFN-γ)的表达有抑制作用，进而影响CD4+T细胞的抗原呈递。此外，研究[31]还表明：肿瘤细胞分泌的外泌体可以诱导T细胞凋亡，促进免疫逃逸。黑素瘤细胞中存在一些含有黑素小体的MVBs，这种MVBs分泌的外泌体内含有Fasl, Fasl可以诱导Jurkat细胞和淋巴细胞凋亡。外泌体分泌的FasL和TNF也可以促进人结肠直肠癌中的T细胞凋亡[32]。

5 外泌体与疾病

5.1 外泌体与肿瘤

肿瘤细胞分泌的外泌体可以促进癌症的侵袭和转移。通过自分泌、旁分泌和内分泌等方式，外泌体可以在局部和远处的转移位点形成有利于转移和侵袭的细胞微环境。研究[33]表明：结肠直肠癌细胞分泌的外泌体富含细胞周期相关的mRNA，可以促进内皮细胞的增殖，进而促进肿瘤的生长和转移。胃癌细胞株SGC7901分泌的外泌体通过激活PI3K/Akt和丝裂原活化蛋白激酶/细胞外调节蛋白激酶信号通路促进SGC7901细胞和其他胃癌细胞株BGC823的细胞增殖[34]。在肿瘤侵袭期间，外泌体可以促进肿瘤细胞和周围间质细胞间的通信。如胃肠道间质细胞瘤通过向周围间质释放含有蛋白酪氨酸激酶的外泌体，诱导平滑肌祖细胞向癌细胞的细胞表型转化[35]。

肿瘤细胞分泌的外泌体可以促进癌症部位的血管生成。缺氧状态下的癌细胞可以分泌一些外泌体促进肿瘤部位的血管生成。肿瘤部位血管生成主要由缺氧诱导因子(HIF)介导。研究[36]表明：当乳腺癌细胞轻度(1%)和严重(0.1%)缺氧时，从培养基中分离的外泌体比例分别为(32.3±4.8)%和(90.9±7.1)%，癌细胞分泌外泌体的增加表明其可以调节肿瘤部位的低氧微环境。乳腺癌细胞分泌的外泌体可以促进血管内皮细胞中蛋白酶激活受体2介导的EGF信号通路促进肿瘤部位的血管生成[37]。胶质母细胞瘤样干细胞分泌的外泌体可以将血管内皮生长因子A(VEGF-A)靶向运输到内皮细胞促进血管生成[38]。

外泌体有助于肿瘤微环境中的上皮间充质转化(EMT)。研究[39]表明：在一些肿瘤细胞分泌的外泌体中存在EMT诱导因子，如基质金属蛋白酶(MMP)、白细胞介素6(IL-6)、转化生长因子β(TGF-β)、膜联蛋白A2、整合素3和肝细胞源性生长因子，表明癌细胞分泌的外泌体可能参与EMT过程。另外，Josson等[40]研究证明：携带miR-409的成纤维细胞分泌的外泌体可以在前列腺癌的肿瘤微环境中诱导其相邻上皮细胞的EMT。肿瘤细胞分泌的外泌体可以增加其耐药性。癌细胞通过向外分泌外泌体的方式排出化疗药物，从而增强其对化疗药物的抵抗力。研究171种抗癌药对NCI60细胞系的作用结果[41]显示：NCI60细胞系的耐药性与其分泌的外泌体数量呈正相关关系。另外，外泌体还以其他方式增强癌细胞的耐药性。例如，当顺铂(DDP)加入肺癌细胞(A549)的培养基时，A549分泌的外泌体中与DDP敏感性相关的几种miRNA和mRNA含量明显增多，但具体机制仍需进一步研究。来自肝癌细胞的外泌体富含长非编码RNA-RoR，可以通过介导TGFβ信号通路减少化疗过程中的细胞死亡数量，增强癌细胞耐药性[42]。另外，癌细胞分泌的外泌体中细胞凋亡抑制剂IAP的高表达也与疾病进展和其耐药性相关[43]。

5.2 外泌体与其他疾病

除了与肿瘤发生关系密切外，外泌体还是神经系统疾病致病因子的载体，例如神经变性相关肽Aβ(阿尔茨海默病)、tau(许多神经变性疾病)、朊病毒(传染性海绵状脑病)、α-突触核蛋白(突触核蛋白病，包括帕金森病)和超氧化物歧化酶1(肌萎缩性侧索硬化等)。在神经变性相关蛋白中，只有一些是整合的膜蛋白，即蛋白质位于脂质双层内，而不是细胞内。将蛋白质负载到ILVs或者外泌体中，其更容易与细胞膜表面蛋白结合。目前为止，已经在外泌体中检测到Aβ和PrPc存在，但尚未证明其他膜蛋白的存在[44]。

外泌体还与心血管疾病、代谢性疾病、损伤性疾病以及肌肉骨骼系统疾病有关。从主动脉瘤患者的血浆中分离出的外泌体含有CD9和脂联素，增加了机体患肥胖和代谢综合征的概率[45]。含有胱氨酸C和CD14蛋白的外泌体与动脉粥样斑块大小有关，影响心血管疾病的发病率及患者的死亡率[46]。肠系膜淋巴结细胞分泌的外泌体携带toll样受体4来激活肺泡巨噬细胞，从而诱导急性肺损伤的产生[47]。从老年小鼠的骨髓间质液中分离出外泌体中miR-183的含量明显升高，加快了骨丢失的速度[48]。从发炎关节的滑液中分离出来的外泌体刺激巨噬细胞释放炎性细胞因子、基质金属蛋白酶和趋化因子，介导骨关节炎的发生发展[49]。

6 展 望

在各种生理和病理过程中，外泌体通过与受体细胞特异性结合并传递各种生物学信息从而发挥重要的生物学作用。目前对外泌体基本的生物功能，即其如何介导不同疾病的发病机制知之甚少，进一步深入研究外泌体独特的生物学结构和功能，探讨这些结构的生物学意义，不仅为各种疾病提供了一种安全便捷的早期诊断标记物，也为个体生物学治疗提供了一种靶向性策略，还能为未来药物载体的研发开启一条全新的思路。