不同油气储藏区微生物代谢活性及多样性响应

楚敏，林青，张志东，高雁，史应武，杨红梅，霍向东， 顾美英，曾军，李玉国，欧提库尔，张涛

(新疆农业科学院微生物应用研究所/新疆特殊环境微生物重点实验室，乌鲁木齐 830091)

0 引 言

【研究意义】新疆石油天然气资源蕴藏丰富，有各类沉积盆地49个，主要分布在准噶尔盆地、塔里木盆地、吐鲁番—哈密盆地。中石油就在新疆矿权区内拥有潜在石油资源量156×108t、天然气资源量7.6×105m3，占中石油国内能源量的1/4，但截至目前已探明的油气储量不足其1/5。[1,2]因此，加大相关区域的油气资源勘探，对增大我国能源自给,保障我国能源安全具有重要的意义。【前人研究进展】油气微生物勘探法最早是Mogilewskii[3]在1937 年提出的，其主要原理是利用油气藏中的轻烃气体在压力驱动下，以微泡上浮或连续气相流形式垂直地向上运移，进入表层沉积物过程, 一部分成为土壤中专性烃氧化菌的食物而使烃氧化菌异常发育，预测地层是否存在油气藏。1986～2000 年，Phillips[4]公司在我国南海北部和渤海4个合作区块的勘探中, 先后采用了美国微生物石油调查勘探技术。2007年，微生物石油勘探技术第一次进入我国陆上油气勘探领域[5,6]。土壤微生物群落多样性反映了群落整体的动态变化，通过土壤微生物对不同碳源的利用程度分析，可以进一步了解微生物群落的结构组成[10]。【本研究切入点】焉耆盆地位于新疆巴州境内, 横跨库鲁克山，区域油气蕴藏丰富，类型丰富。目前已在焉耆盆地发现宝浪油田和本布图油田, 在南部凹陷博南地区发现低产岩性油气藏，宝中深层八道湾组发育低产的断鼻油藏[7]。研究土壤微生物群落代谢活性及多样性对地下油气储藏情况的响应。【拟解决的关键问题】采用Biolog-ECO板分析法，对焉耆地区不同含油气的土壤微生物群落结构和碳源代谢特征进行分析，研究其微生物对地下油气的响应，为建立和验证微生物油气勘探技术，加快新疆油气资源的开发奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材 料

样品采集于新疆巴音郭楞蒙古自治州(以下简称巴州)焉耆县境内油气田(86°31′～86°35E，41°06′～42°01′N)，海拔高度在1 042～1 045 m。降水稀少，蒸发量大，日照时间长，热量较为丰富。年平均降水量为64.7 mm，蒸发量大于降水量，年平均蒸发量为年平均降水量的18.5倍，无霜期175 d[ 7,8]。

对照样品采集于巴州和硕县境内农田(86°57′～86°58E，42°16′～42°17′N)，海拔高度在1 100～1 160 m。属暖温带大陆性干旱气候，空气干燥，风沙较多，日照充足。图1

图1 采样区域与焉耆地区地下藏油气Fig.1 The circumstances of sampling area and the oil and gas in the underground reservoir in Yanqi area

样品于2014年4月采集，采集地位于巴州焉耆县内，油气分布[1,8,9]，分别对无地下藏油气、较有利于藏油气和利于藏油气三个区域进行采样。采样以设定区域中心按环形曲线采样，每个区域设8个采样点，每个采样点采用五点梅花采集样本。样品采集取各采样点80～100 cm 土层，并分别用无菌袋密封，放置于车载冰箱4℃保存，并尽快带回实验室进行Biolog试验测定[10]。表1

1.2 方 法

1.2.1 土壤样品理化参数测定

采集土壤样品48 h内(送至新疆农业科学院农业质量标准与检测技术研究所)进行土壤样品测定，包括pH、总盐、有机质、有机碳、全氮等理化参数。样品的pH 值测定采用电位法，总盐测定采用质量法，有机质测定采用水合热重铬酸钾氧化-比色法，全氮测定采用半微量凯氏定氮法。

1.2.2 土壤微生物群落代谢活性

按文献[10]。称取10 g 土壤于90 mL 无菌生理盐水并带有玻璃珠的250 mL 三角瓶中，30℃ 下充分振荡1 h，静置3 min 。将上清液倒入水槽然后静置10 min。按 150 μL/孔加到Biolog-ECO板，置于30℃ 培养10 d，每隔24 h 测定590 nm 处的OD值。

表1 土壤样品采集地理信息

Table 1 Geographic information of the soil sample collection

序号Order number经度Longitude纬度Dimension海拔(m)Altitude无地下藏油气区域(CK)No oil and gas CK1E86.57.413N42.16.9971 108CK2E86.58.412N42.16.8981 115CK3E86.58.544N42.16.8861 112CK5E86.58.544N42.16.8861 112CK6E86.58.011N42.16.9581 116CK7E86.58.755N42.17.0381 116CK9E86.58.894N42.16.9801 116CK11E86.58.803N42.16.9341 114利于藏油气区域(T1)For oil and gas5E86.32.428N42.01.5231 0676E86.32.028N42.01.6351 0578E86.32.010N42.01.9131 06211E86.32.671N42.01.8051 05713E86.32.693N42.01.6991 05716E86.33.225N42.01.2351 05417E86.33.446N42.01.2541 05919E86.33.786N42.01.3931 065不利于或难评价藏油气区域(T2)Or difficult to evaluate the oil and gas23E86.34.360N41.58.7461 05124E86.34.396N41.58.6561 05925E86.34.420N41.58.5431 06127E86.34.695N41.58.4571 05533E86.34.819N41.58.0401 05736E86.35.015N41.57.7701 05038E86.35.397N41.57.0501 05540E86.35.650N41.58.0171 050

1.2.3 数据处理

按Biolog-ECO 板31种碳源的分子结构式分为六大类，即单糖糖苷聚合糖类(7种)、氨基酸类(6种)、脂类(4种)、醇类(3种)、胺类(3种)、酸类(8种)，分析土壤微生物对不同类型碳源的利用情况。

哦，那可能是我这两年不再练武，肌肉力量不行了，所以才得了这腰椎管狭窄症吧。我这样想着。这时候，旁边的小孙儿说话了：“苏大夫，怎么能预防腰椎管狭窄症的发生啊，我有好多同事也都有这样的症状了。”

分别计算OD590与OD750的差，其中数值小于0的修正为0，数值的大小代表土壤微生物代表不同碳源的活性[11]。Biolog-Eco 每孔颜色平均变化率(AWCD)是表征样品中微生物群落对底物碳源利用强度的指标，反映样品中微生物活性、微生物群落生理功能多样性的一个重要指标。微生物代谢总强度采用微平板孔中溶液吸光值平均颜色变化率(Average Well Color Development, AWCD) 来描述，AWCD 值越大，表明土壤微生物代谢功能越强。计算公式如下:

式中，Ci为各反应孔OD590与OD750的差值；R为ECO 板对照孔A1的OD590与OD750的差值。i-R小于零的孔，计算时记为零，即：Ci-R≥0[12]。

微生物群落多样性指数采用Simpson、Shannon-Wiener 和McIntosh 等指数来表征土壤微生物群落功能多样性。

群落Shannon 丰富度指数(H')[13]：

H'=ΣPilnPi.

式中，Pi为第i孔相对吸光值与整板平均相对吸光值总和的比，即：Pi=(Ci-R)/Σ(Ci-R)。

群落Simpson 优势度指数(D)：

式中，ni为第i孔相对吸光值(Ci-R)，N为相对吸光值的总和，Simpson 指数通常用1/D值表示。

式中，ni为第i孔相对吸光值(Ci-R)[14]。

1.3 数据处理

平均吸光值(AWCD)、多样性指数、主成分分析(PCA) 和相关的方差分析等数据处理均采用DPS 9.50进行。

2 结果与分析

2.1 供试土壤样品理化性质

各样品为碱性土壤，有机营养比较匮乏，样品间差异不明显。由表可以看出所采集的样品土壤pH在8.08～8.21，呈现弱碱性；总盐在0.35%～0.40%，有机质在0.41%左右，全氮含量在0.33%左右，总体呈现有机营养匮乏，样品间差异不明显。表2

表2 不同区域样品土壤基本理化性质

Table 2 The basic information and physico-chemical of the soil samples

样品SamplepH总盐Total salt(%)有机质OM(%)全氮Total N(g/kg)CK8.08±0.020.35±0.210.45±0.040.31±0.00T18.21±0.110.37±0.030.40±0.010.33±0.03T28.09±0.010.40±0.010.41±0.070.33±0.01

2.2 不同土样的微生物群落AWCD

研究表明，来源于不同油气类型土壤样品AWCD值均随培养时间增加而提高，总体上AWCD 值均呈“S”型曲线变化，培养144 h后各样品AWCD基本达到最大值，增长趋于稳定。具体观察，在整个培养期间三类样品的微生物活性存在着明显的差异，总体呈显着T1>T2>T3的规律，即利于藏油气区域微生物活性>不利于或难于评价藏油气区域>无藏油气区域，但T2与T1间差异明显小于与CK的差异。图2

图2 不同类型样品土壤微生物AWCD值

Fig.2 AWCD values of soil microbes in different types of samples

2.3 不同土样微生物群落多样性指数

研究表明，在利于藏油气(T1)和不利于或难评价藏油气(T2)区域样品中的微生物SIMPSON优势度指数、McIntosh均匀度均低于对照区域，且均呈现T1T3>CK的趋势。表3

表3 藏油气样品土壤微生物群落多样性指数

Table 3 The index of soil microbial community in oil and gas samples

序号OrderSIMPSON(D)SHANNON(H)BRILLOUINMcIntosh(Dmc)CK1.021 4233.188 913.078 2871.057 126T10.995 4533.253 4743.536 1220.981 485T21.008 453.251 7543.325 6431.023 951

2.4 不同土样微生物群落对六大碳源利用

根据各样品AWCD变化情况，选取光密度趋于稳定，且不同样品间有较好分形的96 h的AWCD值，进行土壤微生物群落不同类型碳源利用的差异分析。研究表明，各样品土壤微生物对6类碳源代谢和利用存在明显的差别。通过分析样品中土壤微生物利用各类碳源情况，来源于利于藏油气和不利于或难评价藏油气区域的土壤微生物利用6类碳源的活性均高于对照区域，其中，在羧酸类、酚酸类、多聚类、胺类等4类化合物的微生物利用活性中，均呈现T1>T2>T3的规律，与总体AWCD情况一致；而在碳水化合物、氨基酸等2类化合物的微生物利用活性中，均呈现T2>T3> T1的规律。图3，表4

研究表明，三类样品中利用碳水化合物、氨基酸、酚酸的微生物均占主导，总计占70%以上，其次为多聚物占10%以上，而羧酸和胺类所占比例最少，均低于10%。分析不同碳源对各样中总体AWCD的贡献情况可以看出，在利于藏油气和不利于或难评价藏油气区域，即T1和T2样品中，氨基酸和多聚物利用微生物在AWCD的贡献上均高于对照区域，而羧酸、胺类均低于于对照区域。表4

图3 不同类型样品土壤中各碳源AWCD值

Fig.3 AWCD values of carbon sources in different types of soil samples

表4 不同类型样品土壤中各类碳源利用微生物对AWCD贡献

Table 4 Contribution of microbes to AWCD in different types of soil samples

碳水化合物Carbohydrate氨基酸Amino acid羧酸Carboxylic acid酚酸类Phenolic acids多聚物Polymer胺类AmineCK35.1620.477.0418.9111.277.13T133.6421.016.6120.2611.916.56T236.3221.266.3917.8312.785.40

2.5 微生物群落代谢活性主成分(PCA)

主成分分析( principal component analysis，PCA) 是采用降维的方法，使用少数的相互无关的综合指标反映原统计数据中所包含的绝大多数信息。不同类型样品PCA分析表明，前3个主成分可解释样品间70.9%的变异，其中主成分1(PCA 1)、主成分2(PCA 2)分别解释了39.69%、16.63%。以PCA 1、PCA 2对各样品作图，三个不同藏油气区域微生物群落特征，在PCA 1、PCA 2有着明显分异。图4

图4 不同藏油气区域土样微生物群落主成分

Fig.4 Principal component analysis of microbial communities in soil samples from different reservoirs

PCA中的因子载荷可反映不同土壤碳源利用的差异，绝对值越大，表明该基质的影响越大，在众多碳源中起主要分异作用，PCA 1载荷在0.7以上的有15种基质，其中因子载荷系数r>0.8的有10种基质；PCA 2载荷在 0.6以上的2种基质，其中r>0. 8的只有1种为D-木糖。 PCA 1、PCA 2中权重最大的基质为D-甘露醇和D-木糖，分别为载荷值0.97和0.87。表5

表5 主成分因子载荷值

Table 5 Principal component factor load value

碳源carbon sourcePCA 1PCA 2碳源carbon sourcePCA 1PCA 2碳源carbon sourcePCA 1PCA 2ß-甲基D-葡萄糖苷Methyl D- glucoside-0.130.21L-精氨酸L- arginine-0.020.37y-羟基丁酸y-hydroxybutyric acid0.55-0.16D-半乳糖内酯D- galactone0.71*0.04L-天冬酰胺酸L- asparagine acid0.86**-0.28衣康酸Itaconic acid0.43-0.52D-纤维二糖cellobiose0.38-0.19L-苯基丙氨酸L-Phenylalanine0.70*-0.55a-丁酮酸a-butanic acid0.80**0.43I-赤藻糖醇l-Trehalose0.270.39L-丝氨酸l-serine0.70*0.09D-苹果酸D-Malic Acid0.72*0.33a-D-乳糖a--D- lactose0.31-0.59L-苏氨酸L- threonine0.430.69*丙酮酸甲脂Pyruvate methyl ester0.580.31葡萄糖-1-磷酸盐Glucose -1- phosphate0.70*0.54甘氨酰-L-谷氨酸Glycine-L-glutamate0.620.21苯乙基胺Benzethylamine-0.02-0.33D-木糖D- xylose0.250.87**2-羟苯甲酸2-hydroxybenzoic acid0.380.6腐胺Putrescine-0.160.21D-甘露醇D- mannitol0.97**-0.154-羟基苯甲酸4-hydroxybenzoic acid0.96**-0.19D-葡萄胺酸D- glucosaminic acid0.87**-0.25N-乙酰基-D-葡萄胺N-acetyl-D-glucamine0.560.51吐温80Twain 800.80**-0.43肝糖Liver sugar0.79**0.4D,L-a-甘油D, L-a- glycerol0.230.56吐温40Twain 400.88**-0.23D-半乳糖醛酸D- galactosidonic acid0.86**-0.27a-环式糊精a- cyclodextrin0.86**-0.32

注：*显著，**极显著

Note:*marked，**Extremely significant

3 讨 论

我国先后在渤海湾盆地浅海海域、琼东南盆地、松辽盆地，青海省的苏干湖盆地、柴达木盆地等地区，开展了相关微生物油气勘探[15-21]。丁力等[22]针对准噶尔盆地中拐凸起火山岩储层岩性变化大、油水分布规律复杂、油气勘探面临较大困难等问题，运用微生物地球化学勘探技术通过检测地表土壤中烃氧化菌的丰度差异，研究土壤吸附气的组成特征，来圈定油气分布范围，判别油气藏流体性质，结果发现，检测结果与工区已知钻井试油结果具有较高的吻合度，证实了微生物地球化学勘探技术在中拐凸起火山岩油气藏勘探中的适用性。

Biolog微平板技术最初主要用于微生物菌种鉴定的一种技术，通过分析微生物利用单一碳源情况，进行数值分析。由于该技术操作简单、快速、获得数据量丰富，随着近年来微生物生态学研究的深入，样品间利用Biolog微平板碳源代谢差异，分析微生物群落代谢功能多样性已成为一种重要的分析手段。研究前期，研究团队利用Biolog革兰氏阴性板进行了新疆玛北油气藏区微生物群落代谢活性[23]，采用判别分析模型判断油气藏区微生物异常，结果发现，油气藏区判别正确率为97.8%，非油藏区判别正确率为100%，总判别正确率为98.6%，证明BIOLOG技术能高效准确的用于油气藏初步勘测[15]。

研究分别从新疆焉耆无地下藏油气、较有利于藏油气和利于藏油气三个区域进行采样。将采取的52个土壤样品进行土壤理化性质分析和BIOLOG法对研究背景区域内油气藏区、非油气藏区以及各样点间的土壤微生物群落代谢功能差异进行研究。结果表明，在整个培养期间三类样品的微生物活性存在着明显的差异，总体呈显着T1>T2>T3的规律，即利于藏油气区域微生物活性>不利于或难于评价藏油气区域>无藏油气区域。多样性指数分析表明，在利于藏油气和不利于或难评价藏油气区域样品中的微生物SIMPSON优势度指数、McIntosh均匀度均低于对照区域，而 SHANNON(H)丰富度指数、BRILLOUIN指数结果相反，表明地下油气对该区域的样品微生物组成和分布有影响。土壤微生物利用各类碳源情况分析表明，来源于利于藏油气和不利于或难评价藏油气区域的土壤微生物利用6类碳源的活性均高于对照区域，在羧酸类、酚酸类、多聚类、胺类等4类化合物的微生物利用活性中，均呈现T1>T2>T3的规律；各样品中不同碳源代谢微生物对AWCD的贡献情况表明，利于藏油气和不利于或难评价藏油气区域样品中，氨基酸和多聚物利用微生物在AWCD的贡献上均高于对照区域，而羧酸、胺类均低于对照区域。主成分分析表明，三个不同藏油气区域微生物群落特征，在PCA 1、PCA 2有着明显差异，PCA 1、PCA 2中权重最大的基质为D-甘露醇和D-木糖，分别为载荷值0.97和0.87，进一步验证BIOLOG技术能用于油气藏初步勘测。

4 结 论

新疆焉耆三个区域地下土壤微生物群落明显受油气分布影响。微生物代谢活性总体呈现利于藏油气区域微生物活性>不利于或难于评价藏油气区域>无藏油气区域的规律；在利于藏油气和不利于或难评价藏油气区域样品中，氨基酸和多聚物利用微生物在AWCD的贡献上均高于对照区域，而羧酸、胺类均低于对照区域。主成分分析表明，三个不同藏油气区域微生物群落分布特征有着明显差异，PCA 1、PCA 2中权重最大的基质为D-甘露醇和D-木糖，分别为载荷值0.97和0.87。