鲜牛奶中黄曲霉毒素M1检测的几种方法及控制措施

徐 琳

(黑龙江省杜尔伯特蒙古族自治县动物卫生监督所,黑龙江 大庆 166200)

1 理化性质

黄曲霉毒素M1(AFM1)是黄曲霉毒素B1(AFB1)的羟基化衍生物，二呋喃环的氧杂萘邻酮作为其基本结构，分子式为C17H12O7，相对分子量为328Da，熔点可高达299℃。AFM1是一种无色的长方形片状结晶，在365 nm紫外光照射下会呈现蓝紫色荧光，其在极性有机溶剂中容易溶解，但在非极性溶剂(如乙醚、石油醚和正己烷等)中无法溶解。该毒素具有极强的耐热性，只有在温度达到299℃是才会被破坏，因此牛奶中所含的AFM1经过常规烹调温度、超高温灭菌或者巴氏消毒后基本上不会被破坏。AFM1在部分化学试剂(如丙酮和次氯酸钠)作用下可完全被分解，因此常用于对污染过AFM1的材料或者容器进行解毒。

2 检测方法

免疫亲和柱法。原理是对检测样品先进行离心、脱脂、过滤处理，接着使用免疫亲和柱对滤液进行层析净化，将所含杂质除去后再来洗脱AFM1，之后通过荧光光度法对AFM1进行定量。样品预处理，即取50 mL液体牛奶和牛乳制品放入离心管中，添加氯化钠1 g，溶解后以4000 r/min的速度进行10 min离心，上层为脂肪层，移取下层液体，经过玻璃纤维滤纸过滤后备用。柱净化，即先连接玻璃注射器和免疫亲和柱，准确吸取10 mL之前处理好的澄清滤液加入，接着连接空气压力泵，通过压力调节控制溶液以3～6 mL/min的速度流过免疫亲和柱，直到柱体有2～3 mL空气通过，之后加入10 mL 10%甲醇溶液对柱子进行2次清洗，流出液体全部弃去，再准确加入1 mL 80%甲醇溶液将已经免疫结合在柱上的AFM1洗脱，注意此时调整流速变为1～2 mL/min，将洗脱液收集在干净的玻璃试管中待检。荧光光度检测，先分别在激发波长360 nm和发射波长450 nm下对荧光光度计进行校准，绿色标定管为0，红色标定管为2.0，黄色标定管为1.0±0.2；接着在50 mLAFM1显阴性的样品中分别添加浓度为0、0.1 μg/L、0.5 μg/L、1 μg/L的AFM1系列标准溶液，按照以上分析步骤进行分离纯化，在滤过的洗脱液再分别添加1 mL 0.002%溴溶液和AFM1产生衍生物，放入荧光光度计中对荧光强度进行测定，由此绘制荧光强度和AFM1标准浓度的标准曲线；最后在待检样品洗脱液添加溴溶液衍生，对其荧光强度进行测定，根据标准曲线计算其中所含的AFM1。该检测方法的优点是净化效果好、灵敏度高、特异性高等，同时样品的前处理过程明显简化，不需要使用AFM1标准物质，使操作者在实验过程中可能受到的潜在危害大幅度降低。但整个操作比较复杂、繁琐，且容易出现浪费试剂和环境污染的情况，导致在一定程度上限制该方法的应用推广。

酶联免疫吸附法(ELISA)。原理是固定于酶标板上的抗原和待检样品中所含的AFM1会特异性竞争抗体，并在固相载体表面构成抗原抗体复合物，将多余抗体成分洗去后添加酶标Ⅱ抗，与抗体反应，在酶的作用下促使显色剂显色，根据显色深浅程度对样品中所含的AFM1量进行判断。样品处理，即取50 mL待检牛奶样品，先进行降温处理，直到温度低于10℃，接着以3500 r/min的速度进行10 min离心，之后用吸管吸去上层脂肪层，取下层牛奶液进行检测。检测时，先将抗AFM1抗体包被于微孔板上，置于4℃条件下进行过夜处理，使其充分封闭；先在每孔中添加AFM1标准溶液或者样品处理液，接着添加AFM1酶结合物，置于37℃下经过30 min反应；洗板后在每孔中分别添加酶基质和显色剂，置于37℃下进行15 min显色，通过目视法或者仪器法进行测定；根据结果绘制标准曲线，并据此计算样品中所含的AFM1量。该检测方法的优点是特异性强、灵敏、快速、成本低等，仪器操作简单，使工作人员的劳动量明显减少，且待检样品无需经过特殊处理，可直接进行测定，在有大批样品进行检测筛选使用，且在现场检测时也可选用。

3 控制措施

严格管理奶牛饲料。奶牛禁止饲喂发生霉变的饲料，因此在饲料生产、加工、运输、保存过程中要加强管理，避免收获饲料原料时经受雨淋，且经过适当晒干。合理控制青贮饲料质量，防止腐败，青贮饲料制作完成后要立即使用塑料薄膜覆盖，尽可能使其密封。调控精饲料(如玉米、豆粕等)的含水量和温度。确保饲料贮存条件良好，要求仓库干燥、阴凉，且适当通风，还要注意饲料四周要留有适当的储存空间。料仓要定期进行清洁，避免鼠咬和发生虫害等，尤其是仓中全部腐败变质的饲料必须清理干净。

加强检验检测。要求乳制品生产企业采取质量安全责任，并根据相关法律法规进行生鲜牛奶收购，且必须对其黄曲霉毒素M1等各项指标进行检测。如果生鲜乳检测不合格，要依法采取无害化处理。