荧光PCR熔解曲线技术在地中海贫血产前诊断中的应用

马占忠 范舒舒 徐静 刘玉兰 钟延东 郭艳乐 肖凤金 吴平

（汕头大学医学院附属粤北人民医院，广东 韶关 512026）

地中海贫血（简称地贫）是全球分布最广、累及人群最多的单基因遗传病，也是危害严重的公共卫生问题。该病高发于我国南方地区，广东人群地贫基因携带率高达16.83%［1］。重型地贫是致死或致残性遗传病，给患者家庭和社会带来沉重的精神和经济负担。开展产前诊断是预防重症地贫患儿出生最有效的措施［2］。目前，地贫基因产前诊断的方法主要有跨越断裂点PCR技术（Gap-PCR）、PCR＋导流杂交技术等，但这些方法手工操作烦琐、耗时长，且实验过程中的影响因素多等局限性［3］。广东省卫生计生委颁布的《地中海贫血产前诊断技术规范》中要求地贫基因产前诊断的标本需要两次独立检测，结果一致时方可发出报告。因此，临床上迫切需要一种更加高效、快速、准确的新技术用于地贫基因产前诊断。本研究将探讨荧光PCR熔解曲线法在地贫基因产前诊断中的应用价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2015年1月至2018年5月到粤北人民医院进行地贫基因产前诊断的143例标本（包括130例羊水、7例绒毛和6例脐血）。孕妇及家属签署知情同意书后，经有资质的临床医生在B超引导下按标准操作规程采集产前标本送检。

仪器：BIOER PCR仪、BIO-RAD CFX96荧光定量PCR仪、DYY-8C电泳仪、ChampGel5000凝胶成像分析仪、HB-2012A核酸杂交仪、ABI3130xl遗传分析仪、Sebiacapillarys2 fp电泳仪和Thermo CO2恒温培养箱等。

1.2 方法

1.2.1 鉴定产前标本有无母体细胞污染 用STR鉴定绒毛和羊水标本有无母体细胞污染，血红蛋白电泳鉴定脐血标本有无母血污染。羊水标本发现肉眼可见的红细胞污染时先进行羊水细胞培养，再取贴壁细胞进行鉴定和地贫基因检测。

1.2.2 地贫基因检测 α-地贫和β-地贫基因按标准操作规程和试剂盒说明书进行检测。每份标本均用3种方法检测。有结果不一致时，送亚能生物技术有限公司和广东凯普生物科技股份有限公司进行DNA测序确认。

1.2.3 随访确认 对进行产前诊断后出生或流产、引产的胎儿进行地贫基因复查和随访，以确认产前诊断结果准确可靠。

2 结果

2.1 绒毛和羊水标本经STR分析，脐血标本经血红蛋白电泳分析均未发现母体细胞污染。

2.2 产前地贫基因检测结果 共检测了143例产前地贫基因（包括116例产前α-地贫基因和27例产前β-地贫基因），检出重型α-地贫20例，重型β-地贫7例。

荧光PCR熔解曲线法检测116例产前α-地贫基因标本与Gap-PCR检测结果均一致，与导流杂交法有1例不符，荧光PCR熔解曲线法和Gap-PCR检测结果是-α3.7／αα，导流杂交法检测结果是--SEA／-α3.7，该标本 DNA 测序结果为-α3.7／αα，经实验分析是由于该例绒毛标本有极微量母体细胞污染，导流杂交法灵敏度高，导致假阳性。荧光PCR熔解曲线法检测结果符合率达100%，见表1。

表1 116例产前α-地贫基因检测结果

荧光PCR熔解曲线法检测27例产前β-地贫基因标本与PCR-反向点杂交技术检测结果均相同，与导流杂交法有1例不符，荧光PCR熔解曲线法和PCR-反向点杂交技术检测结果是IVS-II-654M／N，导流杂交法检测结果是IVS-II-654M／CAPM，该标本DNA测序结果为IVS-II-654M／N，经实验分析是由于该例绒毛标本有低比例母体细胞污染，导流杂交法灵敏度高，导致假阳性。荧光PCR熔解曲线法检测结果符合率达100%，见表2。

3 讨论

荧光PCR熔解曲线法是通过荧光PCR仪实时监测温度和荧光强度的变化生成熔解曲线，通过分析探针与靶序列形成杂交体的熔点温度（Tm值），不同突变点有不同的熔解温度，据此计算野生型与突变型Tm值的差值（△Tm），即可判断突变位点［4］。在临床上已经应用于G6PD缺乏症、结核分枝杆菌和沙门菌分型等疾病的检测［5-7］。

表2 27例产前β-地贫基因检测结果

荧光PCR熔解曲线法与传统的PCR＋电泳或杂交法比较有以下优点：①快速：PCR仪直接判读结果，免去了电泳和杂交等繁琐的人工操作环节，整个过程可在3小时内出结果；②闭管操作，最大程度减少交叉污染；③基因覆盖范围广：不仅可以判断探针覆盖的突变类型，还可以发现探针覆盖区域的未知突变点；④检测结果可直接导入实验室信息系统，减少人工判读和输入时的差错［8］。

荧光PCR熔解曲线法也存在局限性：①可检测到探针覆盖区域的其他突变，但是无法判断具体类型，还需要通过其他方法进一步确诊；②仪器自动判读有时会出错，需要人工对每个标本每个通道的峰型进行判断和审核；③仪器要求高，需要仪器具备多通道荧光检测和高分辨熔解曲线分析功能。

任何一种检测技术均存在其方法学的优缺点。根据国家规定，产前诊断项目需两次独立检测，结果一致时方可发出报告。实践证明，最好采用不同技术原理的两种方法独立检测，相互验证，提高准确率，防止漏诊误诊造成的严重后果，为预防出生缺陷提供技术保障。

本研究中143例产前样本中检出重型地贫27例，经遗传咨询医生与孕妇及家属进行沟通，在签署知情同意后选择了终止妊娠，有效避免了重症地贫患儿的出生。尤其开展11～14周绒毛产前地贫基因检测，可以更大程度地减轻对孕妇的身心伤害。但绒毛采样流产风险和母体细胞污染的风险需要警惕。本研究中经STR检测均未发现母体细胞污染，但在地贫基因检测发现2例绒毛标本，导流杂交法与其他两种方法检测结果不一致，最终测序分析是由于发生低比例的母体细胞污染所致。导流杂交法检测地贫基因的高灵敏度和STR检测母体细胞污染的低灵敏度都值得警惕。肖奇志等［9］研究报道中也表明导流杂交法灵敏度高于其他方法。有研究证实当母体细胞污染比例小于10%时，STR方法可能无法测出［10，11］。实践中仍需探索排除产前诊断标本母源污染的有效方法，避免误诊。

综上所述，荧光PCR熔解曲线法检测143例产前地贫基因结果与传统的Gap-PCR和反向点杂交技术检测结果一致，结果准确可靠，可应用于地中海贫血基因产前诊断。