中华大节竹耐盐基因IsSOS1的克隆与序列分析

王 澍，冯 力，李 倩，杜 鹃

（西南林业大学 园林学院，云南 昆明650224）

Na＋／H＋逆向转运蛋白在植物抵御盐胁迫过程中起着非常重要的作用［1］。质膜型Na＋／H＋逆向转运蛋白负责Na＋的外排，将细胞质中的Na＋逆向运送到胞外高Na＋环境中，保持细胞中Na＋的平衡，防止Na＋对细胞质中细胞器的伤害［2］。近几年，一些植物包括黄瓜（Cucumis sativus）［3］、锦葵（Malva Sinensis Cavan）［4］、唐古特白刺（Nitraria tangtaorum）［5］、菊花（Dendranthema morifolium）［6］、长叶红砂（Reaumuria trigyna）［7］的质膜型Na＋／H＋逆向转运蛋白基因等都已被克隆和鉴定。

一些竹类植物具有一定的耐盐性包括刚竹（Phyllostachys viridis）、白哺鸡竹（Ph．dulcis McClure）、早竹（Ph．praecox）、红竹（Ph．iridescins）、淡竹（Ph．glauca McClure）等［8－12］。云南竹类资源最为丰富，中华大节竹（Indosasa sinica）在云南河口天然竹林的面积约为8 580 hm2，开发潜力很大。竹子耐盐性研究起步较晚，但在盐胁迫生理、耐盐性鉴定和耐盐品种筛选等方面取得了一定成果［13］。课题组前期研究表明中华大节竹具有一定的耐盐性，该文根据质膜型Na＋／H＋逆向转运蛋白基因家族的保守序列设计引物，首次利用RACE方法克隆出了中华大节竹质膜型Na＋／H＋逆向转运蛋白基因，同时命名为IsSOS1，并对其序列进行生物信息学分析，为开发和利用竹类植物耐盐基因资源提供了理论依据。

1 材料和方法

1.1 植物材料及处理

中华大节竹（Indosasa sinica）来源于昆明世博园，取母竹并移植于西南林业大学温室内。用150 mmol·L－1NaCl处理幼苗3 h，取中华大节竹的根、茎和叶，迅速用液氮速冻，并保存于－70℃冰箱中，用于RNA的提取。

1.2 质膜型Na＋／H＋逆向转运蛋白基因的克隆

用OMEGA公司的植物RNA试剂盒，提取中华大节竹幼苗（根、茎和叶）的总RNA。混合RNA后，用PrimeScript 1st strand cDNA Synthesis Kit试剂盒（Takara）进行反转录合成第1链cDNA待用。

根据拟南芥和水稻等模式植物的SOS1基因序列，根据其保守区域的序列设计简并引物IsSOS1-F1和IsSOS1-R1（表1）。以反转录合成第1链cDNA为模板，进行PCR扩增。PCR反应体系为50μL：cDNA模板为1.0μL，上和下游引物（10μmol·L－1）分别为1μL，10×Buffer（Mg2＋）为5μL，dNTPs Mixture（10 mmol·L－1）为4μL，ExTaq DNA聚合酶（5 U·μL－1）为0.5μL，最后补37.5μL的灭菌水。PCR扩增的反应条件见表1，通过PCR的扩增，获得了约700 bp的中间片段，测序后把该基因片段序列在NCBI网站中，进行BLAST比对，结果显示该片段与水稻和拟南芥的SOS1基因序列较高的同源性。

参照RACE试剂盒说明书，利用SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit（Clontech，USA）试剂盒中已知的引物，根据中间片段设计特异引物IsSOS1-3′和IsSOS1-5′，分别进行3′RACE和5′RACE的扩增，通过巢式PCR分别获得3′和5′片段。3′片段和5′片段PCR反应条件见表1。纯化后的PCR产物连接载体（pMD-19T）后转化大肠杆菌，进行测序。用Vector NTI 12软件拼接中间、3′和5′片段，获得了IsSOS1基因全长cDNA序列。根据拼接出的全长序列，设计特异引物IsSOS1-F2和IsSOS1-R2通过PCR扩增（表1），PCR扩增后获得含有IsSOS1基因全长编码框的cDNA序列。

表1 引物序列及PCR扩增反应条件Tab.1 Primer sequences and condition for PCR

1.3 IsSOS1基因的生物信息学分析

用vector NTI 12软件对IsSOS1基因序列分析、拼接、ORF识别和蛋白质翻译，用DNAMAN5.2软件完成氨基酸序列比对，并通过Mega4.1软件（Neighbor-Joining方法）构建同源序列的系统进化树。同时，用ProtParam软件（http：／／web.expasy.org）对其进行蛋白组分析。用TMpred程序（http：／／www.ch.embnet.org／software／TMPRED_form.html）对氨基酸跨膜进行分析预测。

2 结果与分析

2.1 IsSOS1基因的cDNA克隆

本文利用RACE技术设计简并引物IsSOS1-F1和IsSOS1-R1（表1），以中华大节竹（Indosasa sinica）mRNA反转录后的cDNA第1链为扩增模板，经过PCR的扩增获得约700 bp基因片段。设计特异引物IsSOS1-3′和IsSOS1-5′，分别进行3′RACE和5′RACE的扩增，通过巢式PCR分别获得3′和5′片段。用Vector NTI 12软件拼接中间、3′和5′片段，获得了IsSOS1基因全长cDNA序列。设计特异引物IsSOS1-F2和IsSOS1-R2（表1）通过PCR扩增，得到长度为3 516 bp的cDNA序列。Vector NTI 12软件分析结果显示，该全长序列包含3 105 bp的开放阅读框，同时编码1 035个氨基酸残基，该序列含有起始密码子ATG和终止密码子TGA。

2.2 生物信息学分析

用ProtParam ExPASy（http：／／web.expasy.org）软件对其进行蛋白组分析，显示IsSOS1推测分子式C5219H8259N1417O1511S43，分子量为11.64 kDa，总正电残基（Arg＋Lys）为102，总负电残基（Asp＋Glu）为108，等电点为pI＝6.52，理论推导半衰期为30 h。

通过TMPRED program软件进行跨膜分析，结果显示IsSOS1包含9个跨膜片段（图1）。IsSOS1氨基酸序列与拟南芥AtSOS1和水稻OsSOS1的氨基酸序列同源性较高，同源性分别为50.3%和76.63%（图2）。

图1 IsSOS1跨膜区分析Fig.1 Tranmembrane analysis of protein IsSOS1

图2 IsSOS1氨基酸序列与拟南芥和水稻氨基酸序列的比对分析Fig.2 Amino acid sequence analysis of IsSOS1 compared to Arabidopsis（AtSOS1）and rice（OsSOS1）

2.3 IsSOS1蛋白进化树分析

用中华大节竹的IsSOS1序列在NCBI中进行Blast（图3）。聚类分析结果显示，Is SOS1氨基酸序列与禾本科植物（水稻和芦苇）质膜型Na＋／H＋逆向转运蛋白（SOS1）的序列同源性较高，同时也显示Is SOS1与液泡型的Na＋／H＋逆向转运蛋白氨基酸序列亲缘关系较远，同源性而质与膜型Na＋／H＋逆向转运蛋白亲缘关系近（图3）。

图3 不同种类植物的质膜型SOS1的系统发育树Fig.3 Phylogenic analysis of SOS1 genes from different plant species

3 结论与讨论

通过RACE方法从中华大节竹中克隆了质膜型Na＋／H＋逆向转运蛋白基因，命名为IsSOS1（基因登录号：KC113048）。IsSOS1序列分析结果显示，IsSOS1的全长为3 516 bp，其中开放读码框为3 105 bp，编码了1 035个氨基酸多肽。其分子量为11.64 kDa，pI（等电点）＝6.52。氨基酸同源性和聚类分析证实，氨基酸同源性和聚类分析证实，IsSOS1氨基酸序列与拟南芥AtSOS1和水稻OsSOS1的氨基酸序列同源性较高，分别为50.3%和76.63%，但是与液泡型的Na＋／H＋逆向转运蛋白氨基酸序列同源性较低。

通过TMPRED program软件进行跨膜分析，结果显示IsSOS1包含9个完全跨膜片段，这与其它研究报道的结果不同［10］。另外，IsSOS1蛋白序列的5′端缺失较多的一段蛋白，这样的缺失推测可能影响该基因的功能，鉴于IsSOS1蛋白序列特性，本实验室已经开展酵母互补功能表达分析，对其功能进行验证研究。同时，云南竹子资源丰富，我们推测不同竹类植物属间的IsSOS1蛋白序列可能有差异，同时会导致其功能的差异。应该继续深入研究，为利用IsSOS1逆向转运蛋白基因并利用转基因方法提高植物抗盐性，培育抗盐作物品种提供新途径。