人体尿液中卡西酮类毒品的SPE-GC-MS定性定量分析

王 平 ，刘晓云 ，3，刘 遥 ，罗叶锋 ，王 震

（1.广州正孚检测技术有限公司，广东 广州 510663；2.广东正孚法医毒物司法鉴定所，广东 广州510663；3.广州万孚生物技术股份有限公司，广东 广州 510663）

卡西酮类毒品是近些年出现的新型毒品，在世界范围内已形成滥用趋势，其母体结构为卡西酮，主要包括甲卡西酮（methcathinone，MC）、4-甲基甲卡西酮（4-methyl methcathinone，mephedrone）和3，4-亚甲二氧基甲卡西酮（3，4-methylenedioxy-N-methylcathinone，methylone）等。卡西酮类物质滥用会导致健康问题和毒品依赖，过量滥用易造成不可逆的永久性脑部损伤甚至死亡。目前，《精神药品品种目录（2013年版）》已将甲卡西酮、4-甲基甲卡西酮、3，4-亚甲二氧基甲卡西酮收入管制目录。近年来，卡西酮类毒品已在我国沿海地区及陕西、山西等地泛滥[1]，大剂量乙醇与甲卡西酮共同作用甚至可引起死亡的发生[2]。因此有必要建立方便、快捷、准确的人体体内检材中卡西酮类毒品的定性定量检测方法。目前尿液样本中卡西酮类毒品的检测方法有气相色谱-质谱法（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）[3-4]、液相色谱-质谱法（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）[5-6]及固相微萃取-气质联用法[7]等，4-甲基甲卡西酮和3，4-亚甲二氧基甲卡西酮的检测方法[8-9]较少。本研究拟建立尿液样本中甲卡西酮、4-甲基甲卡西酮和3，4-亚甲二氧基甲卡西酮的固相萃取-气相色谱-质谱联用法（solid phase extraction-gas chromatography-mass spectrometry，SPE-GC-MS），用于卡西酮类毒品滥用者尿液中卡西酮类毒品的定性定量检测。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器

甲卡西酮（1.0 mg/mL）、麻黄碱-d3（100 μg/mL）、4-甲基甲卡西酮（1.0 mg/mL）、4-甲基甲卡西酮-d3（100μg/mL）、3，4-亚甲二氧基甲卡西酮（1.0mg/mL）、3，4-亚甲二氧基甲卡西酮-d3（100 μg/mL）均购自美国Cerilliant公司，七氟丁酸酐（heptafluorobutyric anhydride，HFBA）购自美国Regis Technologies公司，色谱纯甲醇与乙酸乙酯购自德国MERCK公司，分析纯盐酸、冰乙酸、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、氢氧化钠购自广州化学试剂厂，实验用水为超纯水，由Milli-Q超纯水系统（美国Millipore公司）制得。

48位正压固相萃取仪（带氮气吹干功能）、固相萃取小柱（CLIN-Ⅱ，691-0353）购自美国SPEware公司，BZF-6020真空干燥箱购自上海索谱仪器有限公司，7890气相色谱仪、5975质谱检测器购自美国Agilent公司。

1.2 样本及前处理

本研究卡西酮类毒品滥用者尿液样本由山西省长治市公安局提供。

取待检尿液样品100μL，加入0.9mL空白尿液样品，加入磷酸盐缓冲液（pH=6.0）平衡。依次加入1mL甲醇、1mL去离子水、1mL磷酸盐缓冲液（pH=6.0）活化固相萃取柱。将平衡好的尿液样品加入固相萃取柱，自然流干；依次用2mL去离子水、1mL 0.1mol/L盐酸洗涤杂质，氮气吹干1 min；再加入2 mL甲醇洗涤杂质，吹干5min。加入乙酸乙酯-氨水（体积比为98∶2）溶液2mL洗脱目标物，收集洗脱液，氮气37℃吹干。加入 25 μL 乙酸乙酯和 25 μL HFBA，混匀，转入钳口进样瓶内，钳紧，65℃加热衍生20 min。待GC/MS分析。

1.3 仪器条件

色谱柱为DB-5MS柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm），购自美国Agilent公司。升温程序：柱温80℃保持1min；以50℃/min升至160℃，保持1min；以10℃/min升至180℃，保持3min；以80℃/min升至300℃，保持0.5 min。进样口温度190℃，接口温度300℃。不分流进样；载气为氦气，流速2.2 mL/min；进样量2 μL；电子能量为70 eV。采用选择离子监测（selected ion monitor，SIM）模式进行定量分析。

1.4 方法学验证

1.4.1 特异性

取9份不同来源的空白尿液样品，其中2份为仅加入内标物的空白尿液样品，1份添加10μg/mL其他毒（药）物成分（吗啡、冰毒、大麻、美沙酮、巴比妥等常见毒品及药物），按1.2节进行前处理，按1.3节操作分析验证方法的特异性。

1.4.2 检出限、定量限和线性

取空白尿液，加入甲卡西酮、4-甲基甲卡西酮和3，4-亚甲二氧基甲卡西酮标准溶液，配制成质量浓度为0、1.0、2.0、3.0、5.0ng/mL的尿液样品，加入内标物，按1.2节和1.3节方法进行前处理和分析。信噪比大于3时对应的质量浓度即为本方法检出限，信噪比大于10对应的质量浓度即为本方法定量限[10]。

将甲卡西酮、4-甲基甲卡西酮和3，4-亚甲二氧基甲卡西酮标准溶液添加至空白尿液中配制成质量浓度为0、25、50、100、200 ng/mL 的样品，再加入50 μL 1000ng/mL内标液按1.2节进行前处理，按1.3节进行分析。以质量浓度为横坐标（x），对应质量浓度的响应值与内标物响应值的比值为纵坐标（y），绘制不强制过零点的一元线性方程，计算回归方程及相关系数。同时分5d做平行重复测试，计算回归方程及相关系数。

1.4.3 精密度和准确度

取空白尿液，配制成质量浓度为50 ng/mL及150ng/mL的标准添加样品，每个质量浓度配制6个样品，连续5 d，根据检测结果计算该方法的日内、日间精密度[以相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）表示]以及准确度。

1.4.4 回收率、基质效应和稳定性

取空白尿液，按以下方法配制成质量浓度为50 ng/mL和100 ng/mL的标准添加样品：在固相萃取前加入标准溶液（测得峰面积为A）、经固相萃取后添加标准溶液于洗脱液（测得峰面积为B）、不做处理直接添加标准溶液（测得峰面积为C）。分别检测上述3种前处理条件下样品的峰面积，按照下列公式计算样品前处理的回收率以及基质效应：

另外，取空白尿液配制50 ng/mL和100 ng/mL两个质量浓度水平3个平行的标准添加样品，按照1.2节方法对样品进行前处理，分别在样品处理当天及室温放置24 h后按1.3节方法进行定量分析，确定24 h内样品稳定性。

2 结果和讨论

2.1 特异性

空白尿液样品在卡西酮类毒品衍生物出峰时间无干扰峰，方法的特异性较好。空白尿液及空白尿液中添加目标物的总离子流图见图1～2。卡西酮类毒品的保留时间及特征离子见表1。

图1 空白尿液样品的总离子流图

图2 空白尿液样品添加卡西酮类毒品的总离子流图

表1 卡西酮类化合物及内标物保留时间、特征离子及相对丰度

2.2 线性范围、检出限及定量限

尿液中甲卡西酮、4-甲基甲卡西酮和3，4-亚甲二氧基甲卡西酮在相应的线性范围内线性关系良好，相关系数（r）＞0.99，检出限均为2.0 ng/mL，定量限均为25.0ng/mL。结果见表2。

2.3 精密度和准确度

本研究各待测物的准确度为95.8%～107.7%，精密度为0.5%～5.7%，均满足准确度和精密度的要求。结果见表3。

2.4 回收率、基质效应和稳定性

本研究各待测物提取回收率为98.4%～105.7%，表明固相萃取的前处理方法可达到较好的萃取效果。基质效应均落在-5.4%～3.4%区间内，固相萃取的方法对待测成分的抑制较低，给准确定量提供了保障，内标法的回收率及基质效应均满足要求。结果见表3。

50 ng/mL和100 ng/mL两个质量浓度3个平行的标准添加样品，在24h后的测试值和当天测试值相对误差均小于5%。结果见表4。

表2 尿液样品中3种卡西酮类毒品的线性方程、相关系数、检出限、定量限

表3 尿液样品中3种卡西酮类毒品的精密度、准确度、回收率和基质效应 （%）

表4 尿液样品中卡西酮类毒品固相萃取稳定性 （n=3，±s，ng·mL-1）

表4 尿液样品中卡西酮类毒品固相萃取稳定性 （n=3，±s，ng·mL-1）

测试时间/h 0 24甲卡西酮50ng·mL-1 55.7±1.5 54.3±1.1 100ng·mL-1 95.1±2.3 96.8±3.4 4-甲基甲卡西酮50ng·mL-1 50.1±0.6 49.7±0.5 100ng·mL-1 98.6±0.5 96.8±0.6 3，4-亚甲二氧基甲卡西酮50ng·mL-1 50.2±0.8 49.8±0.3 100ng·mL-1 99.1±0.6 99.0±0.4

2.5 案例应用

收集1例疑似卡西酮类毒品滥用者的尿液样品，按1.2节方法进行分析，在样品中检出甲卡西酮成分。采用内标法结合SIM模式进行定量分析，定量结果为1582.0ng/mL，SIM色谱图见图3。

图3 甲卡西酮阳性样品的SIM色谱图

3 结 论

本研究采用SPE-GC-MS方法建立了人体尿液样本中甲卡西酮、4-甲基甲卡西酮和3，4-亚甲二氧基甲卡西酮的定性定量检测方法，同位素内标物与目标物理化性质接近，降低了目标物在样品前处理和仪器测定过程中产生的误差，保证了定量的准确性和稳定性。鉴于涉毒案例尿液中卡西酮类毒品的浓度范围变化较大，高浓度阳性样品可通过空白尿液稀释来弥补线性范围不足的缺点。

本研究建立的方法准确、灵敏，可用于卡西酮类毒品滥用者尿液中卡西酮类毒品的定性定量检测分析。