紫外分光光度法与高效液相色谱法测定板栗花水提液中总黄酮含量的比较研究

王凤春+曾滟棱

摘要 [目的]建立板栗花水提液中总黄酮含量的快速、准确测定方法，为产品开发提供技术支持。[方法]以槲皮苷为对照品，分别采用紫外分光光度法与高效液相色谱法测定板栗花水提液中总黄酮的含量。[结果]紫外分光光度法测得总黄酮的含量为4.62 mg/mL，高效液相色谱法测得总黄酮的含量为4.64 mg/mL，2种方法所得结果基本一致。[结论]紫外分光光度法与高效液相色谱法均可用于板栗花水提液中总黄酮的准确定量，但在实际生产应用中完全可用紫外分光光度法替代高效液相色谱法对总黄酮的含量进行快速测定。

关键词 板栗花水提液；总黄酮；紫外分光光度法；高效液相色谱法

中图分类号 TS201 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2018）02-0255-03

Comparison of Quantitative Determination of Total Flavonoids in Water Extracts of Chestnut Flower by UV Spectrophotometry and HPLC

WANG Feng-chun 1 ZENG Yan-ling 2

（1 Research and Development Center of Chestnut Industry of Qianxi County，Qianxi Hebei 064300； 2 School of Chinese Materia Medica，

Beijing University of Chinese Medicine）

Abstract [Objective]To establish rapid and accurate quantitative determination method of total flavonoids in water extracts of chestnut flower and provide technical support for product development.[Methods]Taking quercitrin as the contool，UV spectrophotometry and HPLC were used to determine the content of total flavonods in water extracts of chestnut flower，respectively.[Results]The content of total flavonoids determined by UV spectrophotometry was 4.62 mg/mL，and by HPLC was 4.64 mg/mL.The content of total flavonoids obtained by the two methods were basically consistent.[Conclusion] Both UV spectrophotometry and HPLC could be used for accurate quantitative determination of total flavonoids in water extracts of chestnut flower，but in actual production，UV spectrophotometry could completely replace HPLC to determine the total flavonoids quickly.

Key words water extracts of chestnut flower；total flavonoids；UV spectrophotometry；HPLC

板栗花為壳斗科（Fagaceae）栗属植物板栗（Castanea m-ollissima Bl.）的雄性花序，具有涩肠止泻的功效[1]，民间用其水煎剂治久治不愈的细菌性痢疾，疗效较好。已有研究表明，板栗花主要含黄酮[2]、多酚[3]、挥发油[4]、木脂素[5]及甾体[6]等多类化学成分，其中黄酮（苷）类成分的含量最高。已报道的黄酮类化合物包括栗黄酮苷A、栗黄酮苷B、槲皮素（querc-etin）、槲皮素-3-O-β-D-半乳糖苷（quercetin-3-O-β-D-ga-lactopyranoside）、槲皮素-3-O-（6"-O-没食子酰基）-β-D-半乳糖苷[quercetin-3-O-（6"-O-galloyl）-β-D-galactoside]、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸甲酯（quercetin-3-O-β-D-glucuronic acid methyl ester）、异鼠李素（isorhamnetin）等[6]。这些黄酮类成分具有多种对人体有益的保健功能，如抗氧化、抗病毒、抗过敏、抗菌、抗发炎及血管舒张作用等[7]，可被用于药品及保健功能食品的开发。随着人们生活水平的提高和对自身健康重视程度的日益增强，消费者迫切需要找到一种安全、无毒并食药两用的物质。而自然界广泛分布的黄酮类化合物恰好能满足人们的这一要求，因而研究板栗花的食用价值对食品与医药工业的发展均具有重要意义。

板栗花水提液富含具有营养保健功能的黄酮类物质[8]，对其进行合理利用，如研制保健型植物提取饮料[9]，既具有可观的经济效益，又可解决板栗花疏雄后雄花资源浪费的问题。有效物质含量标准的制定是保证功能食品质量的重要环节，而目前尚无对板栗花水提液中黄酮含量测定方法的研究报道。本研究以槲皮苷为对照品，对紫外分光光度法与高效液相色谱法进行比较，发现二者均可用于板栗花水提液中总黄酮含量的准确测定，而采用紫外分光光度法测定更为简便和快捷。该结果可为板栗花水提液的产品开发提供方法指导和数据支持。endprint

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

1.1.1 仪器。U-3010型紫外-可见分光光度计（日本Hitachi）；Agilent 1260型高效液相色谱仪（美国Agilent）；Zorbax Eclipse Plus C18色谱柱（4.6×250 mm，5 μm，美国Agilent）。

1.1.2 材料与试剂。板栗花水提液（迁西县板栗产业研究发展中心，批号201706）。提取方法取新鲜板栗花适量置挥发油提取器中，加纯水（料液比为1∶1）混合浸泡后，在0.1 MPa的蒸汽压力下加热，当罐内温度达到110 ℃时，蒸汽压力控制在0.1 MPa，持续循环蒸馏3 h，罐内下层液体即为板栗花水提液样品。

槲皮苷对照品（中国食品药品检定研究院）；色谱级甲醇（美国Sigma-Aldrich），色谱级乙腈（美国Sigma-Aldrich），色谱级甲酸（美国Sigma-Aldrich）；去离子水由Millipore-Q水纯化系统（美国Millipore）制备。

1.2 试验方法

1.2.1 紫外分光光度法测定总黄酮的含量。

（1）对照品溶液的配制。称取槲皮苷对照品12.30 mg，用适量50%甲醇（水溶液，下同）溶解后，完全转移至10 mL容量瓶，再加50%甲醇定容至刻度，摇匀，制得1.230 mg/mL对照品储备液，备用。准确量取对照品储备液5.0 mL，置于25 mL容量瓶中，加入50%甲醇定容至刻度，摇匀，制成0.246 mg/mL对照品溶液。

（2）供试品溶液的制备。移取板栗花水提液样品2.5 mL，过滤后置于500 mL容量瓶中，先加入纯甲醇2.5 mL，再加入50%甲醇定容至刻度，摇匀，即得供试品溶液。

（3）检测波长的选择。取对照品溶液1.0 mL，加入50%甲醇稀释9倍后，以50%甲醇为参比溶液，在190～400 nm波长范围内进行光谱扫描。再取供试品溶液适量，同法进行光谱扫描，以确定检测波长。

（4）线性关系考察。分别取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL对照品溶液，置于15 mL容量瓶中，加入50%甲醇定容至刻度，摇匀，即得系列浓度的标准溶液。以50%甲醇为参比溶液，在255 nm波长下测定各标准溶液的吸光度。以吸光度（y）对质量浓度（x，μg/mL）进行线性回归，进行线性关系考察。

（5）精密度和稳定性考察。取对照品溶液1.0 mL，加入50%甲醇稀释9倍后，以50%甲醇为参比溶液，在255 nm波长下测定吸光度，重复6次。计算得RSD为0.25%，表明仪器精密度良好。取供试品溶液适量，以50%甲醇为参比溶液，在255 nm波長下分别在0、20、40、60、80、100、120 min时测定吸光度，对精密度和稳定性进行考察。

（6）重复性考察。取6份供试品溶液，以50%甲醇为参比溶液，在255 nm波长下测定吸光度，进行重复性考察。

（7）加样回收率考察。取6份1.0 mL 23.12 μg/mL供试品溶液，分别准确加入1.0、1.0、1.5、1.5、2.0、2.0 mL稀释14倍的对照品溶液（16.4 μg/mL），以50%甲醇为参比溶液，在255 nm波长下测定吸光度并计算总黄酮量，进行加样回收率考察。

（8）样品测定。准确移取适量供试品溶液，以50%甲醇为参比溶液，在255 nm波长下测定吸光度，重复3次。

1.2.2 高效液相色谱法测定总黄酮的含量。

（1）色谱条件。色谱柱为Agilent Zorbax Eclipse Plus C18色谱柱（4.6×250 mm，5 μm）；柱温30 ℃；进样体积10 μL；流动相为乙腈-水（水相含0.1%甲酸），梯度洗脱程序为0～10 min，乙腈20%～80%；流速1.0 mL/min；紫外检测波长255 nm。

（2）对照品溶液的制备。准确量取1.230 mg/mL对照品储备液5 mL，置于25 mL容量瓶中，加入50%甲醇定容至刻度，摇匀，制成0.246 mg/mL对照品溶液。取对照品溶液0.5 mL，加入50%甲醇稀释9倍，过滤后在上述条件下进行HPLC分析。

（3）供试品溶液的制备。移取板栗花水提液样品2.5 mL，过滤后置于50 mL容量瓶中，先加入2.5 mL纯甲醇，再加入50%甲醇定容至刻度，摇匀，即得供试品溶液。过滤后在上述条件下进行HPLC分析。

（4）线性关系考察。分别取0.12、0.25、0.50、1.00、2.00、4.00 mL对照品溶液，置于10 mL容量瓶中，加入50%甲醇定容至刻度，摇匀，即得系列浓度的标准溶液。在上述条件进行色谱分析，记录峰面积，进行线性关系考察。

（5）精密度和稳定性考察。取对照品溶液1.0 mL，加入50%甲醇稀释9倍后，在上述条件下进行色谱分析，记录峰面积，重复6次。取适量供试品溶液，在上述条件下分别在0、20、40、60、80、100、120 min时进行色谱分析，记录峰面积，进行精密度和稳定性考察。

（6）重复性考察。取6份供试品溶液，在上述条件下进行色谱分析，记录峰面积，进行重复性考察。

（7）加样回收率考察。取6份1.0 mL 231.50 μg/mL供试品溶液，分别准确加入1.0、1.0、1.5、1.5、2.0、2.0 mL稀释0.5倍的对照品溶液（164.00 μg/mL），在上述条件下进行色谱分析，记录峰面积，进行加样回收率考察。

（8）样品测定。准确移取适量供试品溶液，在上述条件下进行色谱分析，重复3次，记录各色谱峰的峰面积。分别取平均值，代入回归方程，计算得供试品溶液中总黄酮的含量。

2 结果与分析endprint

2.1 紫外分光光度法测定总黄酮含量的结果

2.1.1 检测波长的选择。对照品溶液与供试品溶液在255 nm附近均有最大吸收（图1），故选择255 nm为检测波长。

2.1.2 线性关系考察。以吸光度（y）对质量浓度（x，μg/mL）进行线性回归，回归方程为y=0.024 1x-0.013 1，相关系数r=0.999 8。结果表明，在8.20～41.00 μg/mL范围内槲皮苷的吸光度与浓度呈良好的线性关系。

2.1.3 精密度和稳定性考察。根据测定的对照品溶液吸光度，计算得RSD为0.25%，表明仪器精密度良好。根据测定的供试品溶液吸光度，计算得RSD为0.46%，表明样品的时间稳定性良好，可进行紫外测定。

2.1.4 重复性考察。根据测得的供试品溶液吸光度，计算得RSD为0.51%，表明该方法具有良好的重复性。

2.1.5 加样回收率考察。在255 nm波长下测定的吸光度并计算总黄酮量的结果见表1。计算得平均回收率为100.43%，RSD为3.51%，表明该测定方法合理。

2.1.6 样品测定。3次重复测得样品吸光度分别为0.544、0.542、0.545。取平均值代入回归方程，计算得供试品溶液中总黄酮的含量为23.10 μg/mL，则板栗花水提液中总黄酮的含量为4.62 mg/mL。

2.2 高效液相色谱法测定总黄酮含量的结果

2.2.1 HPLC分析色谱图。对照品溶液进行HPLC分析所得色谱图见图2，供试品溶液进行HPLC分析所得色谱图见图3。

2.2.2 线性关系考察。对照品溶液以色谱分析峰面积（y）对质量浓度（x，μg/mL）进行线性回归，回归方程为y=15.196x-12.037，相关系数r=0.999 5。结果表明，在2.95～98.40 μg/mL范围内槲皮苷的色谱峰面积与浓度呈良好的线性关系。

2.2.3 精密度和稳定性考察。对照品溶液峰面积RSD为0.15%，表明仪器精密度良好。供试品溶液峰面积RSD为0.23%，表明样品的时间稳定性良好，可进行色谱测定。

2.2.4 重复性考察。计算得6份供试品溶液峰面积RSD为0.22%，表明该方法具有良好的重复性。

2.2.5 加样回收率考察。6份已知浓度的供试品溶液加入稀释的对照品溶液进行色谱分析，记录峰面积，结果见表2。计算得平均回收率为99.95%，RSD为1.05%，表明该测定方法合理。

2.2.6 样品测定。计算得供试品溶液中总黄酮的含量为231.87 μg/mL（表3），则板栗花水提液中总黄酮的含量为4.64 mg/mL。

3 结论与讨论

测定植物提取液中总黄酮含量的常用方法有紫外分光光度法和高效液相色谱法[10]，两者各有所长[11]。紫外分光光度法是测定总黄酮最经典的方法，有着操作简单、灵敏度高等优点，但该方法特征性不强，不同成分的紫外响应差异较大，且对照品的选择对试验结果有着很大影响，因而普遍认为紫外分光光度法不能准确测定总黄酮的含量。高效液相色谱法的准确性、精密度和重复性通常均高于紫外分光光度法，但因为植物提取液成分复杂，色谱分离条件较难确定，且将该法用于定量分析时需要较多的对照品，所以对高效液相色谱法的接受程度不高。

板栗花黄酮具有其特殊性，前期研究中分析板栗花水提液的化学成分，发现槲皮素及其苷（酯）类成分的含量较高。因此，本研究选择在水相中溶解性较好的槲皮苷作为对照品，采用紫外分光光度法和高效液相色谱法对板栗花水提液中的总黄酮进行定量测定，在方法上具有合理性。紫外分光光度法测得板栗花水提液中总黄酮的含量以槲皮苷计为4.62 mg/mL，高效液相色谱法测得板栗花水提液中总黄酮的含量以槲皮苷计为4.64 mg/mL，2种方法所得结果基本一致，重复性高，均能较客观地反映板栗花水提液中总黄酮的含量。另外，本研究结果也说明在实际生产应用中完全可用紫外分光光度法替代高效液相色谱法，对板栗花水提液中总黄酮的含量进行快速测定。

4 参考文献

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